Name: In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 생쥐 해마 치열계 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징 방법을. 바이러스 주입과 GRIN 렌즈 이식을 단일 수술로 통합하여 신경 활동과 인지 기능의 공간 표현을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 상하이 기초 연구를 위한 파일럿 프로그램(Shanghai Pilot Program for Basic Research) - 푸단대학교 21TQ1400100(22TQ019), 상하이시 과학기술 주요 프로젝트, 린강 연구소(Lingang Laboratory, 보조금 번호)의 지원을 받습니다. LG-QS-202203-09) 및 중국국가자연과학재단(32371036).

생쥐의 치상동맥 세포에서 뉴런 활성을 위한 실시간 이미징 

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

여기서 우리는 마우스의 DG에서 생체 내 칼슘 이미징 절차를 설명했습니다. 우리는 이 프로토콜이 다양한 인지 과정에서 DG 기능을 연구하려는 연구자, 특히 유전적으로 식별된 하위 집단에 관심이 있는 경우에 유용할 것이라고 믿습니다. 여기에서는 수술의 몇 가지 핵심 사항을 강조하여 프로토콜의 장점을 설명하고 이 방법의 한계에 대해 논의합니다.
우리는 사용 가능한 문헌에서 DG 이미징에 대한 다양한 절차를 테스트했으며 이 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실험 절차를 최적화했습니다. 우리의 의견으로는, 다음의 세 가지 주요 수정 사항이 프로토콜의 성공률을 크게 향상시켰습니다. 첫째, 모든 수술 과정을 한 번에 시행했으며, 피질하 부위에 대한 많은 칼슘 영상 연구는 두 번의 별도 수술에서 바이러스 주입과 수정체 이식을 수행했습니다. 우리 접근법의 주요 장점은 바이러스 발현과 뇌 조직 회복이 이제 같은 기간 동안 일어나 보통21개월이 걸리는 마우스 준비를 위한 대기 시간을 절반으로 줄인다는 것입니다. 또한 별도의 수술은 100μm 범위의 불일치로 약간의 기울어짐으로 인해 시술이 실패로 이어지기 때문에 마우스의 정확한 위치 변경이 필요합니다. 수정체를 잘못 배치하는 것을 방지하기 위해 일부 그룹에서는 미니스코프를 수정체에 부착하는 방법을 개발하고 이식 수술 중 센서의 신경 세포 발현을 보려고 시도했습니다. 이 해결 방법은 일반적으로 사용되는 입체 장치의 사소하지 않은 엔지니어링이 필요하며 마취 중 뉴런 활동을 억제하기 때문에 사용하기가 복잡합니다. 우리의 방법은 마우스의 위치를 변경할 필요가 없으므로 절차와 관련된 시간과 스트레스를 크게 줄일 수 있습니다.
우리 접근법의 두 번째 핵심은 표적 영역(22)에 소량의 바이러스를 반복적으로 주입하는 것이다. 이로 인해 더 많은 세포가 감염됩니다. 중요한 것은 단일 주입 부위에서 바이러스 부하를 증가시키는 것과 비교했을 때 이 접근 방식은 감염된 세포의 위치가 시야 전체에 균일하게 퍼진다는 점에서 우수한 결과를 산출했다는 것입니다. 또 다른 관련 요점은 바이러스 역가를 희석하면 칼슘 이미징의 품질이 향상된다는 것입니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 과도한 양의 바이러스는 파도와 같은 활동 클러스터의 출현과 관련이 있으며, 이는 이전 보고서23와 일치한다. 처음에는 조직 흡인으로 인해 주사 부위에서 바이러스가 조기에 제거되고 발현이 불충분할 수 있다고 의심했지만, 이러한 현상은 관찰되지 않았으며, 우리 프로토콜은 일반적으로 표적 부위의 강력한 감염을 산출했습니다. GCaMP를 발현하는 형질전환 마우스와 비교했을 때, 바이러스 접근법은 필연적으로 일관성이 떨어지지만 복잡한 육종이 필요하지 않기 때문에 더 유연하게 사용할 수 있습니다. 그러나 GCaMP의 발현이 인접한 뇌 구조로 흘러 들어가거나 표적 뇌 영역에 고르지 않게 분포될 수 있기 때문에 고정 조직에서 바이러스와 수정체의 해부학적 위치를 주의 깊게 검사하는 것이 결과 해석에 매우 중요합니다. region-or cell-type-specific Cre line을 Cre-dependent GCaMP 발현과 결합하면 이미징된 신호의 특이성을 향상시킬 수 있습니다.
프로토콜의 세 번째 요점은 렌즈를 이식하는 동안 렌즈 삽입과 헹굼을 여러 번 반복하여 이식 부위에 혈액이 남지 않았는지 확인하는 것입니다. 이것은 조직 회복을 촉진하고 시술의 성공률을 높이기 위한 핵심 수술입니다. 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 렌즈를 삽입하면 필연적으로 조직에 약간의 손상이 발생할 수 있으며, 헹굼 단계를 통해 이러한 손상과 관련된 출혈을 제거할 수 있을 것으로 추측됩니다. 그렇지 않으면 삽입 관련 출혈이 뇌에서 제거되는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있으며, 이로 인해 국소 염증 및 대식세포 침윤의 가능성이 높아지며, 이 두 가지 모두 광학 품질을 저하시킬 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜에서 제공한 좌표에서 렌즈를 시상 봉합사에 조금 더 가깝게 배치하면 일반적으로 눈에 보이는 세포의 수가 증가하지만 제3뇌실을 뚫지 않는 것이 중요하다는 것을 발견했습니다. 또한 이 단계의 더 나은 문제 해결을 위해 일반적인 문제 목록을 제공했습니다(표 1).
마우스는 머리에 가해지는 추가 무게의 영향을 최소화하기 위해 행동 실험 전에 더미 미니스코프를 착용하도록 훈련받아야 합니다. 일반적으로 이 교육은 ~3일 동안 진행되며 각 세션은 20분 동안 지속됩니다. 행동 실험 중에는 마우스의 신체 상태를 정기적으로 모니터링해야 합니다. 마우스의 행동 성능은 마우스의 건강에 큰 영향을 받습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 칼슘 이미징은 신경 활동의 대리물이며, 이는 센서의 발현에 의해 영향을 받을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 미니스코프를 사용하는 단광자 이미징 방법은 인접 세포에서 신호가 겹칠 수 있으며, 이로 인해 후속 분석에서 디믹싱이 필요할 수 있습니다. 또한, 우리의 프로토콜에는 침습적 수술이 포함됩니다. GRIN 렌즈 이식 단계에서 일반적으로 CA1 영역, 후비장 피질 및 연관 시각 피질의 일부를 포함하는 뇌 조직 덩어리가 제거됩니다. 이는 단광자 조명이 제공하는 이미징 깊이의 제한 때문에 필요합니다. 우리의 관찰에서, 우리는 수술 절차 후 쥐에서 명백한 행동 결함을 발견하지 못했으며, 일반적이고 제한되지 않은 행동이나 선형 추적 작업의 학습에서도 발견되지 않았습니다 (보충 그림 S1). 대안적으로, 뇌 조직 흡입을 위한 자동화된 수술 기구의 사용은 수동 조작과 관련된 오류를 줄일 수 있고, 이에 따라 수술 절차(24)의 정밀도를 향상시킬 수 있다. 더욱이, 우리의 칼슘 이미징 데이터는 일반적으로 정상적인 칼슘 역학을 산출했습니다. 더 복잡한 인지 기능에 미치는 영향은 추가적인 특성화가 필요합니다. 조직 흡인 없이 렌즈를 삽입하는 대체 방법은25년 이전에 설명되었습니다. 이것은 의도된 삽입관을 따라 뇌 조직을 절단하고 렌즈를 개구부를 통해 직접 배치함으로써 달성됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 접근법은 삽입관을 따라 뇌 조직의 접힘 또는 기타 변형을 유발하며, 이는 여전히 침습적일 수 있습니다. 변형의 가변성이 높기 때문에 이 접근 방식은 우리가 설명한 프로토콜보다 신뢰성이 떨어집니다. 프로토콜의 또 다른 잠재적인 주의 사항은 마우스의 동작 성능이 미니스코프와 미니스코프 데이터 수집(DAQ) 상자를 연결하는 동축 케이블에 의해 약간 영향을 받는다는 것입니다. 이것은 여러 번 돌린 후에 전선이 서로 감겨 있을 뿐만 아니라 전선이 작업 중에 마우스에 방해가 될 수 있기 때문입니다. 무선 미니스코프(26 )를 활용하면 이 문제를 효과적으로 해결할 수 있다. 
현재의 한계에도 불구하고 이 방법론은 해마 치상이랑(hippocampal dentate gyrus) 내의 신경 활동 패턴을 연구하기 위해 생체 내 칼슘 이미징을 사용하는 데 관심이 있는 연구자에게 매우 유용할 수 있다고 믿습니다. 예를 들어, 이 in vivo 칼슘 이미징 접근법은 dentate gyrus 영역 내에 특이적으로 place cell을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 이를 통해 장소 세포가 서로 다른 뇌 영역10,27에 걸쳐 정보를 암호화하는 방법을 탐구 할 수 있습니다. 우리의 검증은 이 프로토콜이 합리적으로 재현 가능하고 성공률이 높으며 다른 뇌 영역에 적용될 수 있음을 나타냅니다.

이전 연구에 따르면 해마는 기억을 처리하고 검색하는 데 필수적인 뇌 구조입니다 1,2. 1950년대 이래로 설치류의 해마의 신경회로는 기억 형성, 저장 및 회수를 연구하는 데 초점이 되어 왔다3. 해마 내의 해부학적 구조에는 치상이랑(DG), CA1, CA2, CA3, CA4 및 subiculum4의 하위 영역이 포함됩니다. 이러한 하위 영역들 사이에는 복잡한 양방향 연결이 존재하며, 그 중 DG, CA1 및 CA3는 과립 세포와 피라미드 세포로 구성된 두드러진 삼시냅스 회로를 형성합니다5. 이 회로는 내측 피질(entorhinal cortex, EC)로부터 주요 입력을 받으며 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 연구하기 위한 고전적인 모델이었습니다. 이전의 생체 내 연구는 해마 기능에 대한 연구가 대부분 CA1 6,7에 집중되어 있었는데, 이는 접근이 용이하기 때문입니다. CA1 뉴런은 기억 형성, 통합 및 검색, 특히 공간 기억을 위한 장소 세포에서 중요한 역할을 하지만 해마의 다른 하위 영역도 중요합니다 8,9. 특히 최근 연구에서는 DG가 기억 형성에 미치는 영향을 강조하고 있다. DG의 장소 셀은 CA1(10)의 장소셀보다 더 안정적인 것으로 보고되었으며, 이들의 활동은 상황별 정보(context-specific information)11를 반영한다. 또한, DG 과립 세포의 활동 의존적 표지는 기억 관련 행동을 유도하기 위해 재활성화될 수 있다12. 따라서 DG의 정보 코딩에 대한 더 깊은 이해를 얻으려면 동물이 메모리 의존적 작업을 수행하는 동안 DG 하위 영역의 활동을 조사하는 것이 중요합니다.
당뇨병 활성에 대한 선행 연구는 주로 in vivo electrophysiology를 사용하였다13. 그러나, 이 기술에는 몇 가지 단점이 있다: 첫째, 전기적 기록에서, 신호를 생성하는 다양한 유형의 세포를 직접 식별하기 어려울 수 있다. 기록된 신호는 억제성 세포와 흥분성 세포 모두에서 나옵니다. 따라서 이 두 가지 세포 유형을 분리하기 위해 추가 데이터 처리 방법이 필요합니다. 더욱이, 투영 특이적 소그룹 또는 활동 의존적 라벨링과 같은 다른 세포 유형 정보를 전기 기록과 결합하는 것은 어렵습니다. 또한 DG의 해부학적 형태로 인해 기록 전극이 직교 방향으로 이식되는 경우가 많아 기록할 수 있는 뉴런의 수가 크게 제한됩니다. 따라서, 전기적 기록이 동일한 동물(14)의 DG 구조로부터 수백 개의 개별 뉴런을 모니터링하는 것은 어렵다.
DG에서 뉴런 활동을 기록하는 보완적인 기술은 in vivo calcium imaging15을 사용하는 것이다. 칼슘 이온은 유기체의 세포 신호 전달 과정에 필수적이며, 특히 포유류 신경계 내에서 많은 생리적 기능에서 중요한 역할을 합니다. 뉴런이 활동할 때 세포 내 칼슘 농도가 급격히 증가하여 뉴런 활동과 신호 전달의 역동적인 특성을 반영합니다. 따라서 뉴런의 세포 내 칼슘 농도의 실시간 변화를 기록하면 신경 코딩 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
칼슘 이미징 기술은 특수 형광 염료 또는 유전자 조작 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 형광 강도의 변화를 감지하여 뉴런의 칼슘 이온 농도를 모니터링한 다음 현미경 이미징을 통해 캡처할 수 있습니다16. 일반적으로 녹색 형광 단백질(GFP), 칼모듈린 및 M13 폴리펩티드 서열로 구성된 GCaMP 계열의 칼슘 지시자 유전자가 사용됩니다. GCaMP는 칼슘 이온(17)에 결합할 때 녹색 형광을 방출할 수 있으므로 이미징18을 통해 녹색 형광의 변동을 기록할 수 있습니다. 또한 표적 뇌 영역의 선명한 이미지를 얻기 위해 일반적으로 GRIN 렌즈(Gradient Index Lens)를 관심 영역 위에 이식합니다. GRIN 렌즈는 표면에서 직접 접근할 수 없는 뇌 심부 영역을 이미징할 수 있습니다.
이 기술은 다른 세포 유형을 표지하기 위해 다른 유전 도구와 결합하기가 비교적 쉽습니다. 또한, 이미징 평면이 DG의 세포 방향과 평행하기 때문에 성공적인 수술을 받을 때마다 수백 개의 뉴런에 접근할 수 있습니다. 이 연구에서는 생쥐의 치상이랑에서 생체 내 칼슘 이미징을 위한 완전하고 상세한 수술 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이 절차에는 두 가지 주요 작업이 포함됩니다. 첫 번째는 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 바이러스를 DG에 주입하는 것입니다. 두 번째 수술은 바이러스 주입 부위 위에 GRIN 렌즈를 이식하는 것입니다. 이 두 가지 절차는 같은 자리에서 수행됩니다. 이러한 수술에서 회복 후 다음 단계는 소형 현미경 (miniscope)으로 이미징 품질을 확인하는 것입니다. 이미징 필드에 수백 개의 활성 세포가 있는 경우 후속 절차는 치과용 시멘트를 사용하여 미니스코프 베이스 플레이트를 마우스 두개골에 부착하는 것입니다. 그런 다음 마우스를 이미징 실험에 사용할 수 있습니다. 또한 수집된 칼슘 데이터의 분석을 간소화하기 위한 MATLAB 기반 전처리 파이프라인도 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>200 &뮤; L 범용 피펫 팁</td><td>Transcat 피펫</td><td>1030-260-000-9</td><td>혈액 및 식염수 제거용</td></tr><tr><td>25G luer lock 무딘 바늘(Prebent dispensing 팁)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>뇌 조직 제거용</td></tr><tr><td>3D 인쇄 보호 캡</td><td>해당 없음</td><td>GRIN</td><td>렌즈</td></tr><tr><td>75% 에탄올</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>GRIN 렌즈 표면</td></tr><tr><td>AAV2 / 9-CaMKII &alpha; -GCaMP6f 바이러스</td><td>뇌 케이스</td><td>BC-0083</td><td>바이러스 주입</td></tr><tr><td>용 Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 버전 22.1</td><td>그림을 그리려면</td></tr><tr><td>마취 공기 펌프</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>마취</td></tr><tr><td>용 카메라 제어 소프트웨어</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>행동 데이터를 기록하기 위해</td></tr><tr><td>캐뉼라/세라믹 페룰 홀더 (GRIN 렌즈 홀더)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>GRIN 렌즈를 보관하기 위해</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>마우스의 수술 후 통증을 줄이기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>동축 케이블</td><td>오픈 ephys</td><td>CW8251</td><td>미니스코프와 미니스코프 DAQ 박스를 연결하기 위해</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>뇌 절편 관찰을 위해</td></tr><tr><td>면봉</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>소독용</td></tr><tr><td>맞춤형 헤드 플레이트</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>러닝 휠에 마우스를 잡기 위해</td></tr><tr><td>사용자 정의 헤드 플레이트 홀더</td><td>N / A</td> N <td>/ A</td><td>마우스의 헤드 플레이트를 잡기 위해</td></tr><tr><td>틀니베이스 재료 (자가 경화)</td> <td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>미니스코프</td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>Veet</td><td>ASIN 부착용 : B001DUUPQ0</td> 마우스 데스크탑 디지털 스테레오택시의 <td>털을 제거하기 위해</td></tr><tr><td>SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>바이러스 주사 및 GRIN 렌즈 이식</td></tr>용 <tr><td>Dexamethasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>마우스의 수술 후 염증을 예방하기 위해</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>수술 중 상태 관찰용</td></tr><tr><td>가스 필터 캐니스터, 대형, 6</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>마취용</td></tr><tr><td>GRIN 렌즈</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr><tr><td>GRIN 렌즈</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>유도 챔버 - 마우스 (15cm x 10cm x 10cm)</td> <td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>마취</td></tr><tr><td>산업용 카메라</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>행동 데이터 획득 용</td></tr><tr><td>요오드 소독제</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>소독용</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>마취용</td></tr><tr><td>액체 샘플 수집 튜브(Nanoject III용 유리 모세 필라리 마이크로피펫)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>바이러스 주입용</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>데이터 분석용</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>78001</td><td>개두술용</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>액체 샘플 수집 튜브 당기기용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>바이러스 주입용</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>칼슘 이미징 데이터 기록용</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>칼슘 이미징 데이터를 획득하려면</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>생체 내 칼슘 이미징</td></tr><tr><td>Miniscope V4 베이스 플레이트(변형 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td><td>미니스코프</td></tr><tr><td>nanoject III 프로그래밍 가능한 나노리터 주입기</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>바이러스 주사</td></tr><tr><td>안과 연고</td>용 <td>Cisen Pharmaceutical Co., 주식 회사.</td><td>H37022025</td><td>눈을 촉촉하게 유지하기 위해</td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>바이러스를 희석시키기 위해</td></tr><tr><td>개인용 컴퓨터 (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>칼슘 이미징 데이터 및 행동 데이터를 기록하려면</td></tr><tr><td>Running wheel</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td>베이스 <td>플레이트를 부착 할 때 마우스를 잡기 위해</td></tr><tr><td>스크루 드라이버 (M1.6 나사)</td><td>녹지 (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>60902</td><td>M1.6 나사를 풀려면</td></tr><tr><td>스크루 드라이버 (고정 나사)</td><td>녹지 (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>S2</td><td>고정 나사를 풀기 위해</td></tr><tr><td>고정 나사</td><td>TBD</td><td>2-56 원뿔 점 고정 나사</td><td>미니 스코프를 베이스 플레이트에 고정하기 위해</td></tr><tr><td>작은 동물 마취 기계</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>마취</td></tr><tr><td>메마른 주사기</td><td>장쑤 성 만리장성 의료 기기 Co., 주식 회사</td><td>20163140236</td><td>혈액 헹굼을 위해</td></tr><tr><td>외과 가위</td><td>RWD 생명 과학 Co., 주식 회사</td><td>S14016-13</td><td>머리와 두피 ThermoStar</td></tr><tr><td>온도 조절기를 자르기를 위해, 69025 패드 incl.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>동물의 체온을 유지하기 위해</td></tr><tr><td>초미세 집게</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>뼈 파편 및 dura</td></tr><tr><td>USB 3.0 케이블</td> 제거용 Open <td>ephys</td><td>N/A</td><td>미니스코프 DAQ 상자와 컴퓨터</td></tr><tr><td>UV 광선</td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>연결하려면 두개골</td></tr><tr><td>에 GRIN 렌즈를 고정합니다.UV 수지 (광경화 접착제)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>두개골에 GRIN 렌즈를 고정하기 위해</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>혈액, 식염수 및 뇌 조직을 제거합니다.</td></tr></tbody></table>

in vivo: calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 in vivo 칼슘 이미징) 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

실시간 접근 방식은 일반적으로 학습 및 기억 연구에 필요하며, 생체 내 칼슘 이미징은 행동 작업 중 깨어 있는 동물의 신경 활동을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 해마는 일화 및 공간 기억과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 이 분야의 연구에서 필수적인 뇌 영역이 되었습니다. 최근 연구에서는 생쥐에서 소형 현미경을 사용하여 해마 CA1 영역의 신경 활동을 기록하여 개방 필드 및 선형 트랙을 포함한 행동 작업을 수행하는 방법을 연구했습니다. 치상이랑은 해마의 또 다른 중요한 영역이지만, 깊이가 깊고 이미징이 어렵기 때문에 생체 내 이미징으로 연구된 적은 거의 없습니다. 이 프로토콜에서는 바이러스를 주입하는 방법, GRIN(Gradient-index) 렌즈를 이식하는 방법, 해마의 치상이랑을 이미징하기 위한 베이스 플레이트를 부착하는 방법을 포함한 칼슘 이미징 과정을 자세히 제시합니다. 또한 MATLAB을 사용하여 칼슘 이미징 데이터를 전처리하는 방법을 설명합니다. 또한 이미징이 필요한 다른 뇌 심부 영역에 대한 연구에도 이 방법이 도움이 될 수 있습니다.

그림 1 은 바이러스 주입, GRIN 렌즈 주입, 베이스 플레이트 부착, 미니스코프를 통한 생체 내 칼슘 이미징 및 데이터 처리를 포함한 실험 절차의 개략도를 보여줍니다. 일반적으로 전체 절차는 1개월이 소요됩니다. 그림 2 는 두개골에 뚫린 구멍의 위치와 GRIN 렌즈 이식 전 뇌 조직의 상태를 포함한 바이러스 주입 절차의 예를 보여줍니다.
그림 3 은 이 수술의 성공에 결정적인 역할을 하는 뇌 조직을 제거하는 과정을 보여줍니다. 더 많은 조직이 흡입됨에 따라 다른 조직층이 보이게 됩니다. 이 흡입 단계는 회색 반사층이 관찰되면 중지할 수 있습니다.
그림 4 는 GRIN 렌즈를 삽입하고, 헤드플레이트를 두개골에 부착하고, GRIN 렌즈를 맞춤형 캡으로 덮는 것을 포함한 GRIN 이식 절차를 보여줍니다. in vivo calcium 이미징의 이미징 품질은 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식의 성공 여부에 달려 있습니다.
그림 5는 in vivo 칼슘 이미징의 4가지 유형의 결과를 보여줍니다. 그림 5A는 실패한 결과입니다. 이미징 시야에서 활성 세포가 관찰되지 않았습니다. 그림 5B-D는 성공적인 결과입니다. 그림 5B는 10개 미만의 활성 세포를 가지고 있지만 뚜렷한 혈관은 없습니다. 그림 5C에는 50개 이상의 활성 세포와 가시적인 혈관이 있습니다. 그림 5D에서는 이미징 시야에 수백 개의 활성 세포가 있습니다. 동시에 우리는 깨끗한 혈관을 관찰했습니다. 고품질 in vivo 칼슘 이미징에는 일반적으로 수백 개의 활성화된 세포가 있습니다. 12개 미만의 활성화된 세포는 이미징 결과에 적합하지 않은 것으로 생각됩니다. 일반적으로 세포의 수는 GRIN 수정체의 직경 및 뇌 영역의 부분과 관련이 있습니다. GRIN 렌즈 직경이 크고 뇌 영역이 등 쪽에 가까울수록 더 활동적인 세포를 관찰할 확률이 높아집니다. GRIN 렌즈의 직경이 클수록 쥐의 뇌에 더 많은 손상을 입힌다는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 따라서 적절한 크기를 선택하는 것이 중요합니다. 직경 1mm의 GRIN 렌즈를 이식하는 것은 동물이 선형 추적 행동을 습득하는 능력에 영향을 미치지 않습니다(보충 그림 S1).
행동 데이터와 칼슘 영상 데이터는 일반적으로 별도로 처리됩니다. 마우스 행동 데이터는 수동으로 레이블을 지정하거나 오픈 소스 분석 소프트웨어를 사용하여 처리할 수 있습니다. 칼슘 이미징 데이터는 MATLAB에서 NoRMCorre(Non-Rigid Motion Correction) 및 EXTRACT를 사용하여 처리됩니다. 그림 6 은 시야에 겹쳐진 추출된 개별 세포를 보여주며 성공적인 생체 내 칼슘 이미징 기록에서 얻은 5개의 대표적인 칼슘 흔적을 보여줍니다. 원시 데이터의 대표 비디오는 보충 비디오 S1 을 참조하십시오.
GRIN 렌즈 이식 및 바이러스 주입이 의도한 뇌 영역에서 이루어지는지 확인하는 것은 마지막 단계이며 데이터 해석에도 매우 중요합니다. 그림 7 은 GCaMP6f 발현의 위치(녹색 형광 영역)와 GRIN 렌즈의 궤적을 보여주는 마우스 뇌 절편입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> 그림 1: 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 주입 절차의 다이어그램. (A) AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 바이러스를 치상이랑에 주입합니다. (B) GRIN 렌즈를 치상이랑 위에 이식합니다. (C) 수술 후 영상 품질을 확인하십시오. (D) 확인 후 미니스코프 베이스 플레이트를 부착하십시오. (E) 전체 프로토콜의 타임라인 및 프로세스. 약어: GRIN = 그라디언트 인덱스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> 그림 2: 바이러스 주입 중 대표적인 수술 모습. (A) 마우스를 입체 장치에 놓습니다. (B) GRIN 렌즈 이식 부위(검은색 부분)를 표시합니다. (C) 대상 부위의 개두술. (D) 240nL의 바이러스를 치상이랑에 주입합니다. (E) 주입 후 마이크로피펫을 제거합니다. (F) 피질과 CA1 뇌 조직의 일부를 제거합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> 그림 3: 뇌 조직 흡인 중 대표적인 수술 모습. (A) 검은색 마커로 둘러싸인 영역은 마이크로 드릴을 사용하여 연마하고 (B) 부분적으로 노출된 피질 조직을 남깁니다. 왼쪽 부분은 노출된 피질을 보여주고 오른쪽 부분은 경막과 두개골 조직으로 덮여 있습니다. (C) 대뇌 피질 조직의 흡인 중 대표 이미지. 조직은 옅은 분홍색으로 남아 있습니다. (D) 백색 물질은 흰색 화살표로 표시된 것처럼 시야 내에서 볼 수 있습니다. (E) 추가 흡입 결과 백색 물질 아래에 짙은 회적색의 반사 표면이 드러났습니다. 영역(검은색 화살표)은 CA1 표면으로 생각되며 흡입이 더 깊숙이 들어가지 않아야 합니다. (F) 식염수로 여러 번 헹군 후 해당 부위에서 더 이상 출혈이 보이지 않습니다. 모든 패널에서 별표는 수술 도구를 나타냅니다: 식염수용 30G 뭉툭한 바늘과 뇌 조직 흡인용 25G 뭉툭한 바늘. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> 그림 4: GRIN 렌즈 이식 및 베이스 플레이트 부착 절차의 예. (A) GRIN 렌즈 홀더를 사용하여 GRIN 렌즈를 뇌 조직에 이식합니다. (B) UV 수지로 GRIN 렌즈를 적절한 위치에 부착합니다. 반사 부분은 UV 수지를 나타냅니다. (C) UV 수지를 사용하여 마우스 두개골에 헤드플레이트를 부착합니다. (D) GRIN 렌즈를 3D 프린팅된 보호 캡으로 덮습니다. (E) 수술 품질을 확인합니다. 미니스코프는 홀더로 고정되었습니다. (F) 베이스 플레이트 주위에 의치 모재를 적용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> 그림 5: 이미징 성공 및 실패 결과. (A) 생체 내 칼슘 이미징 결과에 실패했습니다. A 에는 활성 세포가 없으며 여러 영역에 검은색 화살표로 표시된 것처럼 어두운 핏자국이 있습니다. (비-디) 성공적인 in vivo 칼슘 이미징 결과. (B) 10개 미만의 활성 세포를 관찰할 수 있지만 이미징 필드에 중요한 혈관은 관찰되지 않습니다. (C) 50개 이상의 활성 세포와 중요한 혈관을 관찰할 수 있습니다. (D) 수백 개의 활성 세포와 더 중요한 혈관을 관찰할 수 있습니다. 점선 원은 이미징 시야를 나타냅니다. 녹색 화살표는 GCaMP6f를 발현하는 세포를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 혈관을 나타냅니다. 스케일 바 = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> 그림 6: 선형 트랙에서 실행되는 마우스의 대표적인 in vivo 칼슘 이미징 데이터. (A) 미니스코프에 의한 이미징 시야 기록, 총 세포 수 = 227. (B) 대표적인 칼슘 흔적. 셀의 위치는 A에서 같은 색으로 표시됩니다. (C) 행동 작업: 양쪽 끝에 물 보상이 있는 선형 트랙. (D) 마우스의 활동에 대한 행동 분석의 대표 결과; 총 시간 = 100초 파란색 세로선은 핥는 행동의 시점을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> 그림 7: 수술 후 쥐의 뇌 조직 절편. (A,B) 쥐 뇌 조직의 두 가지 예. 직사각형 점선 영역은 GRIN 렌즈 이식 경로를 나타냅니다. 곡선은 해마의 치상이랑(dentate gyrus)을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>문제</td>
			<td>가능한 원인</td>
			<td>용액</td>
		</tr><tr><td>이미징 필드가 어둡거나 검게 나타납니다.</td>
			<td>GRIN 렌즈 아래쪽에는 상당한 양의 잔류 혈액이 있습니다.</td>
			<td>GRIN 렌즈를 이식하기 전에 식염수를 사용하여 더 이상 관찰할 수 있는 출혈이 없을 때까지 수술 부위 표면을 지속적으로 씻어냅니다.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">이미징 필드에 명확하게 볼 수 있는 혈관이 있지만 식별할 수 있는 신경 세포 활동은 없습니다.</td>
			<td>1. 바이러스 발현이 차선책이거나 불량한 경우.</td>
			<td>1. 다음을 확인하는 것이 좋습니다.</td>
		</tr><tr><td>2. 관찰된 바이러스 발현의 위치가 GRIN 렌즈를 이식한 위치와 일치하지 않습니다(일반적으로 GRIN 렌즈의 이식 위치가 원하는 위치에 비해 너무 얕음).</td>
			<td>a. 바이러스 저장 조건이 적절한지 확인합니다.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. 바이러스 주입 위치가 올바른지 확인합니다.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. 바이러스 농도가 적합한지 확인합니다.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. 다음 수술 시 GRIN 렌즈 이식의 깊이를 적절하게 늘릴 수 있으며 실험을 수행할 때마다 정확한 깊이를 주의 깊게 기록해야 합니다.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">이미징 필드는 신경 세포 활동의 일부 지역 패턴을 보여주지만 개별 세포 수준에서는 명확하게 볼 수 있는 활동이 없습니다.</td>
			<td>1. 주입된 바이러스의 양이 과도하게 많았습니다.</td>
			<td>1. 바이러스를 희석하거나 바이러스 주입량을 줄입니다.</td>
		</tr><tr><td>2. 바이러스 발현의 위치가 GRIN 렌즈의 위치와 일치하지 않습니다(일반적으로 GRIN 렌즈는 바이러스 발현의 최적 위치보다 얕은 깊이에 이식됨).</td>
			<td>2. 다음 수술 시 GRIN 렌즈 이식의 깊이를 적절하게 늘릴 수 있으며 실험을 수행할 때마다 정확한 깊이를 주의 깊게 기록해야 합니다.</td>
		</tr><tr><td>이미징 필드 내에는 항상 일관되게 밝은 형광 신호를 유지하는 특정 세포가 있으며, 이 형광의 강도에는 변화가 없습니다.</td>
			<td>바이러스는 단일 세포 내에서 과발현됩니다.</td>
			<td>바이러스를 희석하거나 바이러스 주입량을 줄입니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 문제 해결 차트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 수술을 받은 쥐의 공간 기억 작업의 정상적인 획득. 이 그래프는 매일 20분 세션에서 완료된 임상시험 수의 정량화를 보여줍니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. N = 수술 그룹에서 3 마우스, 수술 없이 그룹에서 4 마우스. 통계적 비교를 위해 이원 분산 분석(Two-way ANOVA)이 사용되었습니다. 약어: ns = 중요하지 않음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 S1: DG에서 칼슘 이미징의 대표적인 원시 데이터. 이 동영상은 5분 동안의 칼슘 활동을 보여줍니다. 비디오가 원래 속도의 10배속으로 재생됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 헤드플레이트의 디자인. 이 파일은 헤드플레이트 설계의 2D 도면을 간략하게 설명합니다. 헤드플레이트의 생산에는 도면에 따라 스테인리스강 절단이 포함됩니다. 사이드바에 있는 두 개의 작은 구멍은 M1.6 나사산으로 두드려야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 3D 프린팅 보호 캡의 설계. 이 파일은 3D 프린터와 함께 사용할 수 있는 보호 캡 슬라이스의 gcode를 제공합니다. 이 프로토콜에서는 폴리락트산 플라스틱을 인쇄의 원료로 사용했습니다. 측면의 작은 구멍은 설치를 위해 헤드플레이트의 탭 구멍 위치와 일치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: 미니스코프 홀더의 디자인. 이 파일은 3D 프린터와 함께 사용할 수 있는 미니스코프 홀더 슬라이스의 gcode를 제공합니다. 원통형 구멍은 M4 나사가 있는 입체 홀더에 설치하는 데 사용됩니다. 측면의 구멍은 조이기 위한 나사를 추가하기 위한 것이지만 홀더는 이 기능 없이 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 원시 칼슘 이미징 비디오 전처리를 위한 Arduino 제어 코드 및 스크립트. 이 파일에는 Arduino를 제어하기 위한 스크립트와 칼슘 이미징 데이터를 전처리하기 위한 코드가 포함되어 있습니다. Arduino 코드는 마우스가 선형 트랙의 교대 끝에서 물 보상을 위해 핥는 방법을 배우는 동작 설정을 제어합니다. 과제를 배우면 생쥐는 트랙에서 반복적으로 앞뒤로 달릴 것입니다. 칼슘 이미징 전처리 코드는 미니스코프로 수집한 데이터에서 파일 형식 변환, 모션 보정, 공간 다운 샘플링 및 셀 신호 추출을 수행합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

출처: Calvo-Rodríguez, et al. 노화된 해마 뉴런에서 세포 내 Ca2+의 형광 및 생물 발광 이미징.J. Vis. Exp. (2015).  이 비디오는 단기 및 장기 쥐 해마 배양에서 세포질 칼슘 수치를 측정하기 위해 형광 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 젊은 뉴런과 노화된 뉴런을 비교함으로써, 노화된 뉴런의 증가된 L형 전위의존성 칼슘 채널 밀도와 장기간의 활성화가 어떻게 뉴런 노화의 특징인 칼슘 과부하를 초래하는지 강조합니다. 형광 칼슘 지표는 자극에 따른 형광 강도의 변화를 통해 이러한 차이를 나타냅니다.

In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

출처: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Vihaving Mouse(자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 헤드 마운트 소형 현미경을 사용한 성공적인 생체 내 칼슘 이미징). J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 구배 굴절률 또는 GRIN 렌즈와 소형 현미경을 사용하여 마우스의 생체 내 칼슘 이미징을 보여줍니다. 이 설정은 마찰이 없는 이동식 케이지 시스템 내에서 머리를 고정하여 뉴런을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. GRIN 렌즈는 뇌의 칼슘 신호를 포착하여 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 실시간 미세내시경 칼슘 이미징

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 마우스에서 신경 역학과 미세 회로를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 미니 스코프를 사용하여 좋은 생체 내 칼슘 이미징을 달성하기 위해 뇌 수술을 수행하는 것을 설명합니다.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 생쥐 해마 치열계 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징 방법을. 바이러스 주입과 GRIN 렌즈 이식을 단일 수술로 통합하여 신경 활동과 인지 기능의 공간 표현을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징)

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