Name: Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 학습하세요 쥐 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하여 원자력 현미경으로 경도를 측정하는 방법을. 이 기술은 당뇨병성 망막병증에서 혈관 경도 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 National Eye Institute/NIH Grant R01EY028242(K.G.), Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD(K.G.), W.M. Keck Foundation의 RIMR(Stephen Ryan Initiative for Macular Research) 특별 보조금(Doheny Eye Institute), Ursula Mandel Fellowship 및 UCLA Graduate Council Diversity Fellowship(I.S.T.)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 UCLA의 안과학과에 대한 Research to Prevent Blindness, Inc.의 무제한 보조금의 지원을 받았습니다. 이 기사의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

Measurement of Stiffness in mouse retinal capillaries and subendothelial matrix(마우스 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 강성 측정)

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

AFM은 대동맥 및 동맥과 같은 더 큰 혈관의 경직도에서 질병 관련 변화를 측정하는 데 널리 사용되어 왔습니다16. 이러한 발견은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 심혈관 합병증에서 내피 기계생물학(endothelial mechanobiology)의 역할을 규명하는 데 도움이 되었다17. 이러한 연구 결과를 바탕으로 우리는 초기 DR에서 망막 미세혈관 병변의 발달에 있어 이전에는 인식되지 않았던 내피 역학의 역할을 조사하기 시작했습니다. 그러나 이 연구의 성공은 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직도의 변화를 정확하게 측정하는 데 달려 있습니다. 최근 연구에 따르면 대형 혈관과 마찬가지로 망막 모세 혈관 및 망막 EC 분비 내피 하 기질의 강성도 AFM 4,5,6을 사용하여 직접적이고 정확하며 신뢰할 수 있게 측정 할 수 있습니다.
이 접근법은 트립신 소화를 사용하여 약간 고정된 눈에서 쥐의 망막 모세혈관을 분리하는 것을 포함합니다. 경험에 비추어 볼 때, 고정되지 않은 눈에서 분리된 모세혈관(hypotonic 방법 사용)은 깨지기 쉽고 단편화되어 AFM 경직도 측정에 적합하지 않기 때문에 이 가벼운 고정 단계가 필요합니다4. 반대로, 다른 망막 트립신 소화 프로토콜18에서 보고된 바와 같이, 더 강한 고정과 그에 따른 광범위한 트립신 소화의 필요성은 또한 단단한 접합부의 파괴에 의해 판단되는 바와 같이 모세혈관 구조적 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 여기에 사용된 가벼운 모세관 고정 및 부드러운 트립신 분해는 과도한 포르말린 유도 가교로 인해 발생하는 강성 아티팩트를 줄이고 신뢰할 수 있는 AFM 강성 측정을 위해 모세관의 구조적 무결성을 보장하는 데 도움이 됩니다.
대안적인 접근법으로, 최근의 한 연구에서는 가볍게 고정된 망막 플랫 마운트에서 망막 모세혈관의 AFM 강성 측정을 보고했다19. 온전한 망막 내의 망막 모세혈관에 AFM 힘 압흔을 수행함으로써 이 접근 방식은 현장 강성을 측정할 수 있습니다. 그러나 이러한 모세관 강성 측정에는 내부 제한막의 강성이 포함될 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 초기 DR20에서 특히 영향을 받는 더 깊은 곳에 있는 모세혈관총은 제외하고 망막 편평산에서 접근할 수 있는 표재성 모세혈관만 측정하는 것으로 제한됩니다. 이러한 문제는 모든 망막층에서 혈관을 깨끗하게(잔류 망막 조직 없이) 추출하는 이 접근법을 사용하여 해결할 수 있습니다. 우리는 현재 초기 AMD의 동물 모델에서 맥락막 혈관을 분리하기 위해 이 프로토콜을 최적화하고 있습니다. 그렇긴 하지만, 프로토콜에 사용된 가벼운 포르말린 고정이 AFM 측정에서 가교 관련 경화 아티팩트를 유발할 수 있다는 것을 알고 있습니다. 따라서 이 접근법을 사용하여 얻은 혈관 경직도 값을 절대 강성보다는 (서로 다른 실험 그룹 간의) 강성의 상대적 변화로 해석하는 것이 현명할 것입니다.
가벼운 고정이 필요한 망막 모세혈관과 달리, 망막 EC 배양에서 얻은 내피하 기질은 수정 없이 평가할 수 있습니다. 이는 주로 배양 배지에 아스코르브산을 첨가하고(콜라겐 합성15를 향상시킴), 탈세포화 중 매트릭스 분리를 방지하는 유리 커버슬립의 화학적 변형, 장기간의 배양 기간(10-15일)을 포함한 여러 요인의 조합으로 인해 발생하는 증착된 매트릭스의 견고성 때문입니다. 중요한 것은, 고혈당증으로 인한 체외피하 기질 경직도의 증가가 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직도의 증가와 일치한다는 것을 보여주었다 4. 매트릭스 강성의 증가는 (기계적 상호성으로 인해) 위에 놓인 망막 EC의 강성을 증가시킬 것으로 예상되며, 이는 함께 전체 모세관 강성을 증가시킬 것으로 예상되기 때문에 놀라운 일이 아닙니다. 실제로, 우리는 최근에당뇨병 질환 4에서 성장할 때 망막 EC가 더 뻣뻣해진다는 것을 보여주었는데, 이는 Rho/ROCK 의존성 액틴 세포골격 장력의 증가를 통해서일 수 있다21. 이러한 발견은 또한 초기 AMD의 붉은털원숭이 모델에서 볼 수 있는 맥락막 EC 경직이 맥락막 내피하 기질(choroidal subendothelial matrix)과 온전한 혈관(12)의 증가된 강성을 반영한다는 것을 의미하며, 이는 진행 중인 연구에서 테스트되고 있는 아이디어입니다. 전반적으로, 고정되지 않은 망막 내피하 기질과 EC의 강성 변화가 경미하게 고정된 온전한 망막 혈관에서 볼 수 있는 추세를 반영한다는 사실은 경미한 고정 접근법의 타당성을 입증합니다.
DR의 동물 모델에서 망막 모세혈관의 직접 강성 측정은 내피 역학을 DR 관리를 위한 새로운 치료 대상으로 확립하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 향후 DR 환자의 망막 모세관 강성의 비침습적 평가를 위한 새로운 고감도 이미징 기술을 개발할 수 있는 강력한 근거를 제공합니다. 이러한 비침습적 기술은 당뇨병으로 인한 심혈관 질환에서 일반적으로 감지되는 동맥 맥파 속도의 변화와 유사하게 모세혈관 경직으로 인해 발생할 것으로 예상되는 혈류의 미묘한 변화를 잠재적으로 감지할 수 있습니다. 당뇨병 기증자로부터 사후 인간의 눈에서 분리한 망막 모세혈관의 AFM 강성 측정은 이와 관련하여 중요한 개념 증명을 제공할 것입니다. 제1형 당뇨병4의 (스트렙토조토신) 마우스 모델에서 망막 모세관 경직도가 초기에 증가한다는 점을 감안할 때, 강성 측정 이미징 방식을 검증하는 데 AFM을 성공적으로 사용하면 초기 DR 발병에 대한 임상 바이오마커로서 망막 모세관 경직을 식별할 수 있습니다.

망막 모세혈관은 망막 항상성과 시각 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 실제로, 초기 당뇨병에서의 퇴행은 당뇨병 환자의 거의 40%에 영향을 미치는 미세혈관 질환인 당뇨병성 망막병증(DR)의 시력을 위협하는 합병증의 발병과 밀접한 관련이 있습니다1. 혈관 염증은 DR에서 망막 모세혈관 변성에 크게 기여합니다. 과거 연구에서는 당뇨병으로 인한 망막 혈관 염증에서 비정상적인 분자 및 생화학적 신호에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다 2,3. 그러나 최근의 연구는 DR 발병에 대한 새로운 패러다임을 도입하여 망막 모세혈관 경직이 망막 혈관 염증 및 퇴행의 중요하지만 이전에는 인식되지 않은 결정 요인으로 식별되었습니다 4,5,6.
특히, 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직도의 증가는 망막 내피 세포(ECs)에서 콜라겐 교차결합 효소인 라이실 산화효소(LOX)의 상향 조절에 의해 발생하며, 이로 인해 내피하 기질(기저막)이 경직됩니다4,5,6. 매트릭스 경직(matrix stiffening)은 차례로 (기계적 상호성으로 인해) 위에 놓인 망막 EC를 경직시켜 망막 모세관 강성의 전반적인 증가를 초래한다4. 결정적으로, 이러한 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경화만으로도 망막 EC 활성화와 염증 매개 EC 사멸을 촉진할 수 있습니다. 망막 EC 결손의 이러한 기계적 조절은 기계적 단서가 생화학적 신호로 변환되어 생물학적 반응을 생성하는 과정인 내피 내피 기계 전달의 변화에 기인할 수 있습니다 7,8,9. 중요한 것은 변경된 EC 기계적 단서와 내피하 기질 구조가 조기 연령 관련 황반 변성(AMD)과 관련된 맥락막 혈관 변성과 관련이 있다는 것입니다.10,11,12 이는 퇴행성 망막 질환에서 혈관 기계생물학의 광범위한 의미를 입증합니다.
특히 당뇨병 초기에 망막 모세혈관 경직이 발생하는데, 이는 망막 염증의 발병과 일치합니다. 따라서 망막 모세혈관 경직성의 증가는 DR의 치료 표적 및 조기 진단 마커 역할을 할 수 있습니다. 이를 위해서는 망막 모세혈관과 내피하 기질의 신뢰할 수 있고 직접적인 강성 측정을 얻는 것이 중요합니다. 이는 세포, 세포외 기질 및 조직의 강성을 직접 측정할 수 있는 독특하고 민감하며 정확하고 신뢰할 수 있는 기술을 제공하는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 달성할 수 있습니다13. AFM은 샘플에 미세(나노뉴턴 수준) 압입력을 가하며, 강성에 따라 압흔 AFM 캔틸레버가 구부러지는 정도가 결정되며, 샘플이 뻣뻣할수록 캔틸레버가 더 많이 구부러지고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 우리는 배양된 내피 세포, 내피하 기질 및 분리된 마우스 망막 모세혈관 4,5,6,11,12의 강성을 측정하기 위해 AFM을 광범위하게 사용했습니다. 이러한 AFM 강성 측정은 내피 역학이 DR 및 AMD 발병의 주요 결정 요인임을 확인하는 데 도움이 되었습니다. 시력 연구에서 기계생물학의 범위를 넓히는 데 도움이 되도록 여기에서는 분리된 마우스 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 강성 측정에 AFM을 사용하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Retinal Capillary Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m PVDF 주사기 필터</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>저단백질 결합 Durapore</td></tr><tr><td>10X 칼슘 % 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>최종 농도 1X, pH 7.4</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Rnase-Dnase-free, 비발열성</td></tr><tr><td>20 mL Luer-Lok TIP 주사기</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 인치 일회용 붕규산 유리/비멸균 파스퇴르 피펫</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm 조직 배양 접시</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>블레이드 홀더</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄소강 수술용 블레이드 #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>치과 왁스</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>최종 농도 5%(v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - 와이퍼 조직</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 스파튤라</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 스테인리스 스틸 115mm&nbsp; 핀셋</td><td>테드 펠라, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정수기 Logic+ Class II, 유형 A2 생물 안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>AmScope</td><td>SM-3 시리즈 줌 삼안 실체 현미경 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드 - 흰색 탭 - 사전 청소 - 25x75x1.0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>트리스 버퍼, 0.1M 용액, pH 7.4 - 생명공학 등급</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 트립신 용액</td></tr><tr><td>트립신 1:250 분말 조직 배양 등급</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (w/v) 트립신 용액</td></tr><tr><td>물 분자 생물학 등급</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Subendothelial Matrix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS with calcium and magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>수산화암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 (12mm)</td> <td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>인간 망막 내피 세포 (HREC)</td><td>Cell Systems</td><td>Corp ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 매체</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>마우스 망막 내피 세포 (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM 측정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &마이크로; m 프로브</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>19 마이크론 높이의 반구형 프로브는 1 마이크론 끝 반경, 스프링 상수 0.25N/m</td></tr><tr><td>70 nm LC 프로브</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>19 마이크론 높이의 반구형 프로브로, 끝 반경이 70nm이며, &nbsp; 스프링 상수 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; 카메라</td><td>XCAM 패밀리</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>데스크탑을 실행합니다.</td><td>Asus</td><td>데스크탑</td><td>Intel i5-6600 CPU, 커버</td></tr><tr><td>슬립</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm 유리 바닥 디쉬용 8GB RAM 디쉬 홀더 &nbsp; 14mm 마이크로 웰</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>연질 생물학적 샘플의 기계적 구조적 특성(강성 및 지형)을 민감하게 측정하기 위해 광학 현미경에 장착된 생명과학 원자력 현미경</td></tr><tr><td>위상차 마이크로스코프</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>10X 대물렌즈가 있는 도립 현미경</td></tr></tbody></table>

isolation of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix for stiffness measurement using atomic force microscopy

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

망막 모세혈관 변성은 당뇨병성 망막병증(DR)의 초기 단계의 임상적 특징입니다. 우리의 최근 연구는 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직이 염증 매개 망막 모세혈관 퇴행에 중요하고 이전에는 인식되지 않았던 인과 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 망막 모세혈관 경직도의 증가는 내피하 기질을 가교하고 경직시키는 효소인 lysyl oxidase의 과발현으로 인해 발생합니다. DR을 조기에 치료하면 DR 진행 및 관련 시력 상실을 예방하거나 늦출 것으로 예상되기 때문에 내피하 기질 및 모세혈관 강성은 조기 DR 관리를 위한 적절하고 새로운 치료 목표를 나타냅니다. 또한 망막 모세혈관 강성의 직접 측정은 동물 및 인간 피험자의 망막 모세관 강성의 비침습적 평가를 위한 새로운 이미징 기술 개발을 위한 중요한 전임상 검증 단계 역할을 할 수 있습니다. 이러한 관점을 염두에 두고, 여기에서는 원자력 현미경을 사용하여 생쥐 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 분리 및 강성 측정을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

생쥐 망막 모세혈관 분리된 망막 모세혈관의 AFM 강성 측정에는 기계구조적 무결성을 잠재적으로 손상시킬 수 있는 시료 처리 단계가 포함됩니다. 이를 방지하여 AFM 측정의 타당성, 신뢰성 및 재현성을 보장하기 위해 적출된 눈은 혈관 격리 전에 4°C에서 하룻밤 동안 5% 포르말린으로 고정됩니다. 포르말린 농도 감소, 낮은 고정 온도, 제한된 고정 시간 및 각막 천자가 없는 이 가벼운 고정 프로토콜은 화학적 고정으로 인한 잠재적인 교차결합/경화 아티팩트를 최소화하기 위해 개발되었습니다. 그림 2B,C에서 볼 수 있듯이 이러한 상대적으로 가벼운 고정은 분리된 망막 혈관이 구조적으로 견고하고 AFM 측정에 충분히 내구성이 있음을 보장합니다. 대조적으로, 고정되지 않은 눈(저긴장법 사용)4 또는 잠시 고정된 눈(8시간 동안)에서 분리된 망막 혈관은 단편화되거나 축소되어 AFM 측정에 적합하지 않습니다(그림 2B).
망막내피하기질(Retinal subendothelial matrix) 혈관 경직도는 혈관 세포와 기저막(내피하 기질)의 결합된 강성을 반영합니다4. 세포는 자체 강성에서 유사한 변화를 겪음으로써 매트릭스 경직도에 적응하기 때문에, 기계적 상호성(mechanical reciprocity)9이라고 불리는 과정인 내피하 기질 강성(subendothelial matrix stiffness)은 전체 혈관 강성의 중요한 결정 요인이 된다. 매트릭스 강성 측정을 위해서는 균일하게 조밀한 내피하 매트릭스를 얻는 것이 중요합니다. 아스코르브산 보충 배양 배지에서 성장한 인간 망막 EC의 경우 일반적으로 10-15일이 소요됩니다(그림 3A)4,5,6. 이러한 배양 기간의 차이는 상업적으로 이용 가능한 1차 망막 EC의 로트 간 차이로 인해 발생할 수 있습니다. 또한, 일반적으로 C57BL/6 마우스의 상업적으로 이용 가능한 망막 EC는 1차 인간 망막 EC 배양과 비교할 때 더 조밀한 매트릭스를 증착하며, 이는 종별 차이를 나타냅니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 위상차 이미지는 거시적 규모에서 매트릭스의 전체적인 보기만 제공합니다. 그러나 더 미세한 나노-마이크로 스케일의 섬유소 구조는 매트릭스 구조 단백질인 콜라겐 IV 및 피브로넥틴에 대한 항체로 면역 표지된 매트릭스의 고해상도 컨포칼 형광 이미지에서 분명해집니다(그림 3B). 이러한 매트릭스 단백질은 또한 특정 인테그린 수용체(integrin receptor)에 결합함으로써 내피세포(endothelial cell)에 지시적인 단서를 제공한다는 점에 유의해야 한다9.
AFM 강성 측정 적절한 캔틸레버 강성(스프링 상수, k)과 프로브 치수를 선택하는 것은 신뢰할 수 있고 민감한 측정에 필수적입니다. 이러한 매개변수는 생물학적 샘플의 강성 및 치수와 일치하도록 선택해야 합니다. 선택한 캔틸레버를 AFM에 장착한 후 적외선 레이저 빔은 캔틸레버 끝에 초점을 맞춰야 하고 반사된 레이저 스폿은 광검출기의 중앙에 있어야 합니다. 이 레이저 정렬은 캔틸레버 편향을 정밀하고 민감하게 감지하여 결과적으로 강성 측정을 보장합니다. AFM 강성 측정은 z-피에조가 캔틸레버를 시료 쪽으로 수직으로 아래로 이동하는 것으로 시작됩니다. 현재로서는 캔틸레버 편향이 없어 접근 곡선의 평평한 기준선을 생성합니다 (그림 4A). 캔틸레버 프로브가 샘플과 접촉하고 움푹 들어가면 캔틸레버가 구부러져 광검출기에 레이저 편향이 발생하며, 이는 접근 곡선의 수직 편향으로 표시됩니다. 샘플에 사전 설정된 압입력(설정점 힘)을 가한 후 캔틸레버는 샘플에서 시작 위치(Z 목표 높이)로 후퇴합니다. 그런 다음 편향된 수축 곡선을 Hertz/Sneddon 모델에 장착하여 샘플의 영률(강성)을 계산합니다.
그림 4에 표시된 대표적인 힘 압흔 측정에서 당뇨병이 있는 마우스에서 분리된 망막 모세관에서 얻은 접근 및 수축 곡선(그림 4B)이 당뇨병이 없는 마우스에서 얻은 접근 및 수축 곡선(그림 4A)보다 훨씬 더 가파르다는 것이 분명합니다. 힘 압입 곡선의 더 가파른 기울기는 힘 압흔에 대한 더 높은 샘플 저항으로 인해 발생하는 더 큰 캔틸레버 편향을 나타내며, 이는 더 높은 샘플 강성을 반영합니다13. 실제로, 여러 힘의 압흔 곡선에 대한 후속 데이터 분석에서 당뇨병에서 쥐의 망막 모세혈관이 현저히 경직되는 것으로 나타났습니다4. 또한 캔틸레버 프로브와 생물학적 샘플 사이의 접촉은 종종 비특이적 표면 접착을 유발하며, 이는 수축 곡선이 기준선을 넘어 확장되는 것에서 볼 수 있듯이 후퇴 중에 음의 캔틸레버 편향을 유발한다는 점에 유의해야 합니다(그림 4B). 또한, 세포, 매트릭스 및 혈관과 같은 생물학적 샘플은 본질적으로 점탄성이므로 힘 압입 후 일부 영구적인 변형 및/또는 겉보기 강성의 변화를 겪을 수 있습니다. 만약 그렇다면, 이것은 접근법과 후퇴 곡선의 정렬 불량(히스테리시스)에 반영될 것입니다. 실제로, 그림 4A와 그림 4B를 비교하면 당뇨병이 없는 마우스에서 더 부드러운 모세혈관의 힘 압흔이 더 단단한 마우스에서 볼 수 있는 것보다 더 큰 히스테리시스를 생성하는 예상 추세를 확인할 수 있습니다. 이전에 보고된 바와 같이(5,6), 망막 EC 배양에서 얻어진 내피하 기질의 강성(Young's modulus)도 앞서 언급한 방식으로 계산됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> 그림 1: 망막 분리를 위해 쥐 눈을 절개 한 개략도. 핀셋을 사용하여 시신경을 고정하고 메스를 사용하여 변연 뒤쪽을 완전히 절개하여 생쥐 망막을 수정체와 전방에서 분리합니다. 보라색 점선은 수직 절개 위치를 나타냅니다. 이 회로도는 과학적인 이미지 및 일러스트레이션 소프트웨어를 사용하여 그려졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> 그림 2: AFM 측정을 위한 온전한 마우스 망막 혈관 분리를 위한 프로토콜 최적화. (A) 스테레오스코프 이미지는 모세관 분리 단계 이전에 약간 고정된 쥐 눈에서 분리된 온전한 망막을 보여줍니다. 척도 막대: 2mm. (B) 4x 배율의 대표적인 위상차 이미지는 다양한 분리 방법을 사용하여 얻은 쥐의 망막 혈관을 보여줍니다. 분리된 혈관의 구조적 무결성과 내구성을 비교한 결과, 4°C(빨간색 상자)에서 24시간 동안 5% 포르말린으로 고정된 적출된 눈에서 망막의 트립신 분해가 AFM 강성 측정에 가장 적합한 망막 혈관구조를 생성하는 것으로 나타났습니다. 이 방법을 사용하여 분리한 망막 혈관은 유리 표면을 따라 균일하게 퍼져 있는 명확한 혈관 네트워크를 나타냈습니다. 척도 막대: 500 μm. (C) (B)에 표시된 것과 유사한 온전한 망막 모세관 네트워크의 고배율(20x) 보기는 약간 고정된 눈에서 얻은 모세혈관의 높은 구조적 무결성을 확인합니다. 척도 막대: 100 μm. 이 수치는4에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> 그림 3: 1차 인간 및 생쥐 REC 배양에서 얻은 탈세포화된 매트릭스. (A) 인간 또는 마우스 REC의 10일(10일) 또는 15일(15일) 배양의 탈세포화 후 유리 커버슬립의 내피하 기질 응집체를 보여주는 20x 배율의 대표적인 위상차 이미지. 스케일 바: 100 μm. (B) 15D 인간 REC 배양에서 획득하고 항-콜라겐 IV 및 항-피브로넥틴 항체로 라벨링된 탈세포화 매트릭스의 대표적인 고배율(100x) 컨포칼 형광 이미지는 조밀한 나노섬유계 콜라겐 IV를 보여줍니다. 및 피브로넥틴 매트릭스. 눈금 막대: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> 그림 4: 마우스 망막 모세혈관의 AFM 강성 측정에서 얻은 힘 거리 곡선. 선 그래프는 (A) 비당뇨병 마우스 또는 (B) 당뇨병 마우스에서 분리된 마우스 망막 모세관의 한 위치에서 단일 힘 압흔 측정의 대표적인 접근(밝은 색상) 및 수축(어두운 색상) 곡선을 나타냅니다. SAA-SPH 1μm 반구형 캔틸레버 프로브를 사용하여 얻은 힘 곡선은 캔틸레버-샘플 거리(z-piezo에 의해 제어됨)와 캔틸레버 편향을 유발하는 적용된 수직 힘 사이의 관계를 플롯합니다. (A) 노란색 화살표는 샘플에 대한 z-피에조 구동 캔틸레버 접근 방식을 나타내고, 흰색 화살표는 캔틸레버 프로브가 샘플과 접촉하는 접점을 나타내고, 녹색 화살표는 설정점(피크) 압입력(*)까지의 캔틸레버 편향을 나타냅니다. (B) 당뇨병성 마우스에서 분리한 망막 모세관에서 얻은 접근 곡선과 수축 곡선 모두 당뇨병이 없는 마우스(A에 표시)의 곡선보다 현저하게 더 가파른 경사를 나타내며, 이는 당뇨병 마우스에서 더 높은 모세관 강성을 나타냅니다. 화살촉은 기준선 아래의 수축 곡선의 하강을 나타내며, 이는 압흔 중 프로브와 샘플 사이의 접착으로 인해 캔틸레버 프로브의 음의 편향을 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

우리는 IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 C57Bl/6J 대조군 마우스, 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에서 심장 세포외 기질의 분리를 설명합니다. 또한 C57Bl/6J에서 분리된 혈관, IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에 대한 혈관 확장 연구를 설명합니다.

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

우리는 원자력 현미경을 사용하여 정상 및 병든 간에서 콜라겐이 풍부한 영역의 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 편광 현미경의 동시 사용은 간 절편에서 콜라겐이 풍부한 부위를 국소화하기 위한 높은 공간 정밀도를 제공합니다.

편광 현미경과 결합된 원자력 현미경을 사용한 간 경화도 측정

이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

학습하세요 쥐 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하여 원자력 현미경으로 경도를 측정하는 방법을. 이 기술은 당뇨병성 망막병증에서 혈관 경도 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

더 많은 동영상 탐색