Name: 쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 자궁 오가노이드를 분리 배양하는 방법을. 이 기술은 여성 생식 생물학 및 자궁 질환 연구에 활용되어 약물 테스트와 유전자 편집 연구에 기여합니다.

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>항-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>토끼, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>항-에스트로겐 수용체 알파</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>토끼, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>항-판 사이토케라틴</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>마우스, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>항-프로게스테론 수용체</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>토끼, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>항-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>마우스, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-에스트라디올</td><td>머크</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 키트-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Pacific Blue</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 오가노이드 수확 솔루션</td><td>R& D 시스템</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA 형광 시스템 키트</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA 형광 시스템 키트</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td>1 & g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC), PerCP</td></tr><tr><td>플루오레세인 TSA 형광 시스템 키트</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 항마우스 IgG, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG/HRP 항체</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 대체</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 마스터 믹</td>스 <td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rat&nbsp;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB 그린 패스트 qPCR 믹스</td><td>타카라</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td>u-슬라이드 8웰 플레이트</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr> 표<tr><td>적 유전자의 qPCR 프라이머&nbsp; <</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Genes</td><td>Company</td><td>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>산곤 바이오</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>쥐 GAPDH R</td><td>산곤 바이오</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Nanog F</td><td>Sangon 바이오</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Nanog R&nbsp;</td><td>상곤 바이오</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Sox2 F</td><td>산곤 바이오 테크</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Sox2 R</td><td>산곤 바이오 테크</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Oct4 F</td><td>상곤 바이오 테크</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Oct4 R</td><td>상곤 바이오</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

reESC와 쥐의 자궁 오가노이드는 그림 1에 요약된 프로토콜에 따라 무게가 200g에서 250g 사이인 6마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐에서 확립되었습니다. 인간 자궁내막 상피 줄기세포의 장기 배양의 성공에 힘입어 REEM 제형은 주로 Y27632, A8301 및 CHIR99021로 구성되었습니다. 체외에서 reESC를 안정화하기 위해 처음에는 효소 및 기계적 기술을 사용하여 쥐 자궁내막에서 자궁내막 세포를 분리했습니다. 그림 2A 의 유세포 분석 결과, 일차 자궁내막 세포는 CD9(49.8%)를 발현하는 상피 세포의 약 50%로 구성되어 있으며, EpCAM(4.49%) 및 CD24(2.64%) 수치는 낮았습니다. reESC에 대한 SSEA-1 마커는 6.58%로 나타났으며, 내피 마커 CD31(30.9%) 및 CD45(70.3%)는 상대적으로 높았다.
그러나 REEM에서 배양하면 P1 reESC가 균일한 소용돌이 또는 다면체 형태를 나타내고 조밀한 클론 구조를 형성하게 되었습니다(그림 2D). REEM에서 개별 요인을 점진적으로 제거하면 reESC의 증식 능력이 감소하게 되었습니다. 클론 형성 분석은 reESC의 안정적인 배양에서 Y27632의 중요한 역할을 강조했습니다(그림 2B, C). 세 번째 계대에서 reESC는 SSEA-1 및 Cytokeratin의 일관된 발현을 보였으며, 이는 배양 중 1차 reESC의 성공적인 확장을 나타냅니다(그림 2F). 더욱이, reESC는 후기 계대에서도 견고하고 안정적인 증식 용량을 유지하여(그림 2E), 현재의 REEM 시스템에서 성공적인 분리 및 확장을 입증했습니다.
오가노이드 배양은 인간 자궁내막 줄기세포에서 유래한 이전에 보고된 시스템에 따라 확립되었습니다8. 3일 이내에 reESC는 중심이 비어 있는 오가노이드와 같은 구조로 빠른 자기 조직화를 보였으며, 이후 크기와 두께가 증가했습니다( 그림 3A 참조). reESC에 의한 오가노이드의 형성을 보여주는 일반적인 HE 염색 결과는 그림 3B에 나와 있습니다. 이러한 오가노이드 배양은 직접 계대성 배양과 동결-해동 주기 후에 Ki67 염색으로 나타나는 높은 세포 생존율에 의해 입증된 바와 같이 계대를 통해 지속될 수 있습니다. 또한, 10세대 오가노이드에서 HE 염색을 수행했으며, 그 결과 오가노이드 구조가 그대로 유지될 수 있는 것으로 나타났습니다( 그림 3E 참조). 또한 qPCR 결과는 Nanog, Sox2 및 Oct4가 P1 세대와 유사한 수준으로 발현되었음을 나타냅니다(그림 3F). 이 발견은 현재 시스템 내에서 오가노이드의 장기 배양 가능성을 시사합니다.
본 연구는 E2 및 P4에 대한 쥐의 자궁 유사 구조의 반응에 대한 예비 조사를 수행했습니다. 그림 4A의 면역형광 염색은 에스트로겐과 프로게스테론 수용체의 존재를 보여주었습니다. E2 보충제 후, 이러한 오가노이드는 속이 빈 구형 형태에서 더 조밀하게 채워진 내부 성장 패턴으로 전이되었습니다(그림 4C). P4에 대한 후속 노출은 조밀한 구조의 투과성을 감소시켜 궁극적으로 분해를 초래했습니다(그림 4B). 이러한 발견은 E2 가 잠재적으로 쥐의 자궁 유사 구조의 추가 분화를 유도하는 반면 P4 는 자가사멸 경로를 유발할 수 있음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
그림 1: 쥐 자궁내막 상피 줄기세포와 쥐 자궁 오가노이드를 확립하는 데 사용되는 절차. 약어 : SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
그림 2: in vitro에서 쥐 자궁내막 상피 줄기세포의 생성 및 장기 배양. (A) 쥐 자궁내막에서 양성 세포의 비율을 보여주는 유세포 분석 분석. (B) 각각 A8301, Y27632 또는 CHIR99021를 포함하거나 포함하지 않은 REEM에서 클론의 결정보라색 염색. 스케일 바 = 1cm. (C) 요인이 있거나 없는 REEM의 클론 번호. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. n = 3명의 기증자(***, p&lt;0.001). (D) 결정 바이올렛 염색이 있거나 없는 P1 쥐 자궁내막 상피 줄기 세포의 광학 현미경 이미지. (E) 통로 1, 통로 7 및 통로 14에서 쥐 자궁 내막 상피 줄기 세포의 CCK-8 분석. 오차 막대는 표준 편차를 나타내며 n = 3을 나타냅니다. (F) 사이토케라틴(Cytokeratin)과 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. 약어 : REEM = reESCs 확장 매체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
그림 3: in vitro 에서 쥐 자궁내막 오가노이드의 생성 및 장기 배양.(A) P1 쥐 자궁내막 오가노이드의 광학 현미경 이미지. (B) 쥐 자궁내막 상피 줄기 세포의 P1 오가노이드에 대한 H&amp;E 염색. (C) 사이토케라틴(Cytokeratin)과 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. (D) Ki67 및 SSEA-1의 발현을 입증하는 면역형광 분석. (E) P 10 랫트 오가노이드에 대한 H&amp;E 염색. (F) P1 및 P10 쥐 자궁내막 오가노이드에서 Nanog, Sox2 및 Oct-4의 발현에 대한 qPCR 분석. GAPDH로 정규화된 표현식(n = 3, 양측 쌍을 이루지 않은 t-검정, n.s. = 유의하지 않음). 약어: H&amp;E = hematoxylin 및 eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
그림 4: E2 및 P4를 사용한 오가노이드의 순차적 배양. (A) 에스트로겐 수용체, 프로게스토겐 수용체 및 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. (B) E2 및 P4에서 배양된 쥐 오가노이드의 광학 현미경 이미지 개요. (C) 광학 현미경 이미지는 E2에서 7일 동안 배양한 후 속이 빈 구체가 오가노이드의 내부 구멍 내에서 조밀하게 변형되는 것을 보여줍니다. 약어: ER = 에스트로겐 수용체; PR = 프로게스토겐 수용체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

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인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

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배우세요 쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 자궁 오가노이드를 분리 배양하는 방법을. 이 기술은 여성 생식 생물학 및 자궁 질환 연구에 활용되어 약물 테스트와 유전자 편집 연구에 기여합니다.

쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화

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