Name: 성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 배우세요 성체 마우스 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스 전달 방법을. 최적화된 프로토콜로 AAV 투여의 일관성과 재현성을 높여 유전자 치료 연구의 신뢰성을 향상시킵니다.

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저자는 NINDS 동물 보호 시설 직원들의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 교내 연구부(Division of Intramural Research, NINDS, 연례 보고서 번호 1ZIANS003129)의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다.

전임상 마우스 모델에서 정맥 주사를 통한 AAV 기반 요법

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AAV 기반 치료법은 유전자 치료 벡터로서 AAV의 다양성으로 인해 단일 유전자 장애에 대한 큰 잠재력을 가지고 있으며, 이를 통해 다양한 질환의 다양한 전달 요구를 충족시키기 위해 AAV를 맞춤화할 수 있습니다 4,5,7,9. AAV는 일반적으로 잠재적 치료제의 안전성과 효능을 테스트하기 위해 전임상 마우스 모델에서 IV 주입을 통해 투여됩니다16. 상이한 주입된 AAV 투여량은 실험 결과에서 현저한 차이를 초래할 수 있으므로, 실험자가 생성된 생체 내 데이터의 타당성 및 견고성을 보장하기 위해 의도된 AAV 투여량을 일관되게 주입할 수 있는 것이 중요하다28. IV 주사는 널리 사용되지만, 기술적으로 까다롭기 때문에 지속적으로 성공적인 주사를 보장하는 기술 수준을 개발하고 유지하기 위해 광범위한 교육과 지속적인 연습이 필요하다 16,17,18,19. AAV를 정확하게 주입하는 것 외에도, 주입된 AAV의 생체 분포 및 표적 조직 또는 세포에 대한 전달 효율을 평가하기 위해 분석을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다(29,30).
이 프로토콜은 7-9주 된 진정되지 않은 마우스에서 AAV를 투여하기 위해 최적화된 IV 주입 프로토콜의 세부 사항을 철저히 설명함으로써 실험자가 IV 주입을 성공적이고 일관되게 쉽게 수행할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다. 여기에 사용된 연령 범위에서 야생형 마우스보다 현저하게 작거나 큰 마우스는 정맥의 가시성이 감소하거나 이 방법에 사용된 억제제와의 비호환성으로 인해 더 큰 도전을 제시할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. tail IV 주사는 혈관 크기가31인 작은 때문에 생후 6주 미만의 마우스에서 시약을 정맥 투여하는 데 적합하지 않다는 것이 이전에 보고된 바 있습니다. 가능하기는 하지만, 체중이 22.0g 미만인 마우스를 성공적으로 주입하는 것은 어려울 수 있습니다. 비정형 크기의 마우스를 사용하는 조사자는 절차에 적응해야 할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 AAV 생체내 분포 및 transduction 효율성을 평가하는 데 사용할 수 있는 여러 분석법을 간략하게 설명합니다.
이 프로토콜을 따르는 동안 몇 가지 중요한 점을 염두에 두어야 합니다. 주입하는 동안 29G 바늘은 바늘이 정맥 내부에 있지 않은 경우 더 큰 저항을 제공합니다. 이는 실패한 주입 시도 동안 우발적인 용액의 혈관 주위 주입으로 손실되는 부피를 줄입니다. 인슐린 주사기는 일반 주사기보다 사체량이 작습니다. 여기에 나열된 것과 다른 주사기 및/또는 바늘을 사용하는 경우 더 큰 데드 스페이스 부피를 설명하기 위해 프로토콜 단계 1.1.3.3에서 추가 주입 부피를 준비해야 할 수 있습니다(예: 의도한 용량에 15μL 대신 30μL 추가).
AAV 투여량을 주사기로 흡입하는 동안 주사기 측면에 미세한 흡인으로 인한 기포가 형성되면 주사기를 주사기 위로 천천히 당겨 넣습니다. 이렇게 하면 대부분의 작은 기포가 제거됩니다. 주입할 의도된 부피에 최소 10-15μL의 AAV를 추가로 로드합니다. 이 추가 부피는 기포를 배출하거나 잠재적인 주입 시도 실패 중에 손실될 수 있는 부피를 설명하기 위한 것입니다. (예: 주입할 목표 부피가 150μL인 경우 주사기에 165μL를 로드합니다(주사기 스케일에서 160μL와 170μL 표시 사이의 중간). 바늘이 정맥 내부에 올바르게 배치되고 주사기의 부피가 성공적인 주입 시도 직전에 165μL인 경우 주사기에 15μL가 남을 때까지(10μL와 20μL 표시 사이의 중간) 시약을 전달하여 150μL(165μL - 150μL= 15μL)를 전달합니다. 베벨 루멘(베벨이 위쪽을 향함)을 주사기 스케일에 맞추면 주입 중에 전달된 부피를 추적할 수 있습니다.
일부 실험자는 발을 딛고 있는 쥐에 비해 정맥 중 하나가 직선이고 쉽게 접근할 수 있도록 쥐를 옆으로 눕히는 것을 선호할 수 있습니다. 그러나 옆으로 눕힌 마우스의 꼬리는 마우스 크기에 따라 다른 각도로 기울어지기 때문에 크기가 다른 마우스를 주입할 때 주입 각도 조정이 필요합니다. 이는 절차의 성공 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 초기 연습 시도 중에 실험자는 선호하는 접근 방식을 결정하기 위해 두 가지 마우스 구속 방향을 모두 시도할 수 있습니다. 마우스를 발에 딛고 있으면 양쪽 꼬리 정맥에 빠르고 쉽게 접근할 수 있습니다. 이렇게 하면 주사 시도가 여러 번 실패한 경우 두 정맥에 대한 접근이 필요한 구속 시간을 줄일 수 있습니다.
측면 정맥을 꼬리 기저부에 가까운(마우스 몸에 더 가까운) 주입하는 경우(특히 체중이 >30g인 마우스의 경우) 꼬리 기저부의 정맥이 원위보다 약간 깊기 때문에 정맥과 평행한 곳에서 정맥에 대해 5°-10°로 주입 각도를 조정합니다.
여기에 나열된 RNase 분해 및 RNA 오염 검사 프로토콜은 20 μL에 총 175-700 ng의 핵산을 함유한 신선 냉동 간 조직에서 분리한 DNA 샘플에서 검증되었습니다. RNase 분해 프로토콜은 또한 RNase 분해 후 벡터 게놈과 마우스 게놈의 존재를 확인하기 위해 신선 냉동 간 조직과 FACS 분류 세포에서 분리한 DNA 샘플에 대해 테스트되었습니다. 결과는 타겟 앰플리콘의 종말점 PCR 증폭의 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 시각화되었습니다.
설명된 방법론을 따르면 IV 주입을 마스터하는 데 필요한 교육 및 연습 시간을 줄이고 주입 성공률을 높여 시약을 절약할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수 없는 고급 장비나 설정 없이 간단하고 일반적으로 사용되는 도구를 사용합니다. 또한, 여기에 나열된 IV 주입 단계는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)와 같이 정맥 주사가 필요한 광범위한 주사제에 적용할 수 있으며, 주사제에 따라 주사제 준비 단계를 적절하게 수정하여 적용할 수 있습니다.

단일 유전자 질환은 희귀 질환의 80%를 차지하며, 전 세계적으로 3억 명이 앓고 있습니다 1,2. 현재 이러한 크게 쇠약해지는 희귀 질환의 대다수에 대해 승인된 치료법은 없습니다 1,2,3. 그러나 단일 유전자 장애는 역기능 유전자를 대체, 보충, 교정 또는 침묵시킬 수 있는 유전자 치료의 이상적인 후보입니다 4,5. 현재 여러 벡터가 개발되어 특정 세포 유형에 유전자 치료를 전달하는 데 사용되고 있습니다 4,6. 이러한 벡터 중 하나는 아데노 관련 바이러스(AAV)입니다. AAV는 비병원성 파보바이러스(non-pathogenic parvovirus)로, 유전자 치료 벡터로 점점 더 많이 사용되고 있다7. 다른 바이러스 벡터와 비교했을 때, AAV는 면역원성이 낮고, 숙주 게놈에 통합될 가능성이 낮으며, 다양한 조직에서 분열 및 비분열 세포를 효율적으로 transduction할 수 있는 능력을 가지고 있습니다 7,8. 또한, 특정 조직 영양성 또는 더욱 감소된 면역원성과 같은 바람직한 특성을 가진 AAV를 엔지니어링하고 식별하기 위한 여러 접근법이 개발되었으며, 이는 다양한 적응증에 대한 바이러스 벡터로서 AAV의 다양성을 크게 향상시킵니다9. 이러한 요인들로 인해 AAV는 널리 연구되는 유전자 치료 벡터가 되었으며, FDA가 승인한 여러 AAV 기반 유전자 치료법의 개발로 이어졌습니다10.
마우스 모델은 일반적으로 생체 내에서 잠재적인 유전자 치료법을 테스트하고 단일 유전자 질환의 병리 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용됩니다. 이는 마우스 모델이 다양한 조건의 병리학을 재현하고, 인간 게놈과 게놈의 유사성, 마우스 취급, 유지 관리 및 생성의 상대적 용이성 때문입니다 11,12,13. In vivo testing은 근육 이영양증과 같이 신체의 여러 시스템 또는 영역에 영향을 미치는 장애를 연구할 때 특히 중요합니다. 이러한 질환의 경우, 체외 검사는 전신 투여 후 다양한 신체 부위에 도달하도록 의도된 치료제의 안전성, 효능, 약동학 및 약력학을 종합적으로 평가하기에 충분하지 않을 수 있다14.
약물을 전달하기 위해 다양한 전신 투여 경로를 사용할 수 있습니다. 각 경로에는 장점, 단점, 연구 대상 동물모델 및 약물과의 호환성 정도가 있다15. 정맥 주사(IV) 측면 꼬리 정맥 주입은 마우스16에서 AAV의 전신 전달을 위해 일반적으로 사용되는 경로입니다. 측면 꼬리-정맥 주사는 주사액을 마우스 혈류에 빠르고 직접 투여할 수 있게 하여 전신 순환에서 높은 약물 생체이용률을 보장한다17. 또한 비교적 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구를 수행해야 합니다. 그러나 주로 꼬리 정맥 직경이 작고 정맥을 찾기 어렵기 때문에 외측 꼬리 정맥 주사는 기술적으로 까다롭고 주사 시도 실패 또는 불완전한 용량 전달을 피하기 위해 높은 수준의 기술과 지속적인 연습이 필요합니다 16,17,18,19. 이로 인해 값비싼 시약이 손실되거나 부정확한 결과가 발생할 수 있으며, 특히 주입을 수행하는 동안 불완전한 주입이 인식되지 않는 경우 더욱 그렇습니다. 여기에 요약된 우리의 경험은 우리의 사용에 맞게 조정한 잘 문서화된 기사에 보고된 프로토콜을 기반으로 하며, 일관되게 성공적인 주입을 보장하기 위해 측면 꼬리 정맥 주입 절차의 다양한 단계를 최적화합니다 20,21,22,23,24,25,26,27.
여기에서는 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구를 사용하여 진정되지 않은 7-9주 된 마우스에 AAV를 전달하기 위해 최적화된 측면 꼬리 정맥 주입 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 당사는 AAV 전달 및 생체 분포를 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 주입 후 조직 수집, 조직 고정, DNA 추출 및 이배체 게놈(vg/dg)당 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR) 벡터 게놈을 다룹니다. 여기에 제공된 IV 주입 프로토콜 및 지침은 측면 꼬리 정맥 주입을 성공적으로 수행하는 용이성을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 이는 주입 기술을 습득하는 데 필요한 시간을 줄이는 동시에 주입의 정확성과 일관성을 향상시키는 데 잠재적으로 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL 인슐린 주사기와 29G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기&nbsp; 튜브</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>조직 고정을 위한 1x PBS 준비에 사용</td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브 홀더</td><td>다중 출처</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190 프루프 에틸 알코올</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>70% 에탄올 1x</td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td> 준비에 사용</tr><tr><td>2 mL microcentrifuge tissue storage tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Adeno-associated virus (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>Single-stranded DNA (ssDNA) AAV는 CMV promoter Alcohol swab BD Biosciences 326895에 의해 유도되는 transgene으로 Cre recombinase를 전달하기 위해 패키징되었습니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비드 용해 튜브</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI (HaeIII) 제한 효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>총알 블렌더</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>JAX 007914 균주에서 Ai14 유래 마우스 (유전 적 배경 : C57BL / 6J)</td> <td>해당 없음</td><td></td><td>Ai14 Cre-reporter 대립 유전자를 포함하는 마우스는 JAX (카탈로그 번호 : 007914)에서 구입했습니다.</td></tr><tr><td>일회용 흡수 패드</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>Dissectionjunps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA 분해 시약(DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraction RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>핵산 추출 중 RNA 분해용</td></tr><tr><td>DNase-free RNase DNA cleanup</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>핵산 후 RNA 분해용 추출</td></tr><tr><td>dPCR 프로브 PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>dPCR 소프트웨어&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>해당 없음&nbsp;</td><td>QIAcuity 소프트웨어 제품군&nbsp;</td></tr><tr><td>고가 플랫폼</td><td>다중 출처</td><td>N/A</td><td>꼬리를 워밍업하는 동안 마우스 억제기를 올리기 위해 빈 피펫 팁 상자가 사용되었습니다</td></tr> 형<tr><td>광 현미경</td><td>다중 출처</td><td>N/A</td><td>여기에 사용된 모델: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>형광 현미경 소프트웨어&nbsp;</td><td>여러 출처&nbsp;</td><td>해당 없음&nbsp;</td><td>여기에 사용된 소프트웨어: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>거즈</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>고속 원심 분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>금속 용기</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>메틸 부탄</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 수</td><td>질 생물학</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>마우스 튜브 억제</td>기 <td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Myfuge 미니 원심분리기</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>중합효소 연쇄 반응 열 순환기</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>모델: C1000 터치</td></tr><tr><td>정밀 와이프</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR 나노플레이트 26k 24-웰</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR 시스템</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>조직에서 DNA 추출에 사용</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA 마이크로 키트</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>게놈 DNA의 정리에 사용되며 소량의 혈액에서 DNA를 분리하는 데 사용됩니다 prtocotol은 FACS 분류 세포에서 DNA를 추출하는 데 사용되었습니다</td></tr><tr><td>설치류 억제기 콘</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 상자</td><td>다양한 출처</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>표면 클리너 및 소독제</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td>다중 소스</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 펜치</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & 회사</td><td>22220A</td><td>모델: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

많은 질환이 여러 장기에 영향을 미치거나 신체의 다른 부위를 침범하기 때문에 서로 다른 부위에 위치한 영향을 받은 세포를 표적으로 하기 위해 전신적으로 치료제를 제공하는 것이 중요합니다. 정맥 주사는 전신 투여를 목적으로 하는 치료법을 평가하는 전임상 연구에서 널리 사용되는 전신 전달 경로입니다. 성체 마우스의 경우, 치료제를 마우스의 측면 꼬리 정맥에 정맥 투여하는 것을 포함합니다. 숙달되면 꼬리 정맥 주사는 안전하고 빠르며 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구만 있으면 됩니다. 그러나 꼬리 정맥 주사는 기술적으로 까다로우며 의도한 용량의 정확한 전달을 보장하기 위해 광범위한 교육과 지속적인 연습이 필요합니다.
여기에서 우리는 우리의 경험과 이전에 다른 그룹에서 보고한 권장 사항을 기반으로 개발한 상세하고 최적화된 측면 꼬리 정맥 주사 프로토콜에 대해 설명합니다. 마우스 억제 장치와 인슐린 주사기를 제외하고 이 프로토콜에는 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 시약과 장비만 필요합니다. 우리는 이 프로토콜을 따르면 진정되지 않은 7-9주 된 마우스의 꼬리 정맥으로 아데노 관련 바이러스(AAV)가 일관되게 성공적으로 전달된다는 것을 발견했습니다. 또한 AAV transduction 및 biodistribution을 평가하는 데 사용되는 이배체 게놈(vg/dg)당 벡터 게놈 및 형광 리포터 단백질의 조직학적 검출을 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 실험자가 꼬리 정맥 주입을 성공적이고 일관되게 쉽게 수행할 수 있도록 도와 기술을 마스터하는 데 필요한 연습 시간을 줄일 수 있도록 돕는 것입니다.

7-9주령의 수컷 마우스에 1.5 × 1012 vg/마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통해 AAV를 주입했습니다. 여기에 사용된 ssDNA AAV는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 Cre 재조합효소 전이유전자를 전달하였다. 주입된 마우스는 Cre 리포터 Ai14 대립유전자에 대해 동형접합성이었습니다. Cre 재조합효소에 노출되면 Ai14 대립유전자 함유 세포가 형광 tdTomato 단백질을 발현합니다. tdTomato 발현은 Cre-유도 게놈 재조합에 의해 발생하기 때문에, tdTomato-발현 세포는 AAV에 의해 직접 transduction 되었거나 transducted cell의 자손 세포인 세포를 나타냅니다. 여기에 표시된 데이터는 1.5 × 1012 vg/mouse에서 AAV9-CMV-Cre를 주입한 마우스를 160 μL(5.8-5.9 × 1013 vg/kg)로 주입한 마우스의 데이터입니다. 마우스는 주입 후 28일 후에 희생하고, 조직을 상기한 바와 같이 수집하였다. 몇 개의 골격근과 간엽을 소화하고 FACS를 사용하여 세포를 수집했습니다. 핵산 추출을 위해 사전 냉각된 메틸부탄을 사용하여 몇 개의 간엽을 즉시 동결했습니다. 몇 개의 골격근과 간엽을 형광 tdTomato의 조직학적 이미징을 위해 고정 동결했습니다. tdTomato는 간(그림 2A)과 대퇴사두근(그림 2C) 전체에 걸쳐 확산적으로 발현되었으며, 이는 AAV9가 두 조직의 다른 영역에 광범위하게 도달하고 전달되었음을 나타냅니다.
신선 냉동 간 및 FACS 분류 세포에서 추출한 DNA를 사용하여 dPCR을 사용하여 vg/dg를 정량화했습니다. Vg/dg 정량화는 분석된 샘플에서 AAV의 주입 일관성과 transduction 효율성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 신선 냉동 간 조직 샘플과 FACS 분류 세포의 1D 액적 산점도를 사용하여 분석의 유효성을 확인했습니다(그림 3A,C). 산점도는 양성 및 음극 분할의 존재, 검출 임계값을 정확하게 결정할 수 있는 양성 및 음극 분할 간의 명확한 분리, 양성 및 음극 분할 사이에 적적이 거의 없거나 적게 존재하여 dPCR 분석의 정확도를 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 모든 기준을 충족하면 dPCR 분석 결과가 유효하다는 것을 나타냅니다. 각 샘플에서 Polr2a 유전자 카피의 수를 정량화하여 마우스 이배체 게놈의 수를 결정하고(2 Polr2a 유전자 카피/마우스 이배체 게놈), Cre recombinase 전이유전자 서열에 대한 프라이머/프로브를 사용하여 바이러스 게놈을 정량화하였다(1 transgene copy/viral genome, 표 1). 신선 냉동 간 조직 샘플과 FACS 분류 세포에 대해 vg/dg 값을 정량화하고 각 샘플에서 각각 187.7 vg/dg 및 4.7 vg/dg의 존재를 보여주었습니다(그림 3B, D). PBS 주입 마우스와 핵산을 함유하지 않은 비템플릿 대조군의 샘플을 음성 대조군으로 사용했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> 그림 1: 정맥 주사 스테이션 개요. (A) IV 주입을 수행하는 데 필요한 도구. 여기에 표시된 것은 (1) 타이머, (2) 마우스 튜브 고정 장치, (3) 절단되지 않은 (4) 절단 플라스틱 고정 콘, (5) 알코올 면봉, (6) 마우스 튜브 고정 장치를 들어 올리는 플랫폼으로 사용되는 빈 피펫 팁 상자, (7) 일회용 흡수 패드, (8) 따뜻한 물이 담긴 15mL 원추형 튜브, (9) 15mL 튜브 홀더, (10) 거즈 및 (11) 인슐린 주사기입니다. (B) 마우스는 먼저 튜브 고정 장치 내부에 배치됩니다. 그런 다음, 마우스가 너무 작아서 튜브 고정 장치로만 구속할 수 없는 경우 절단 억제 원뿔을 삽입하여 마우스 주위에 구속 슬리브를 만듭니다. 마우스의 호흡이 구속기에 의해 방해받지 않는지 확인하십시오. 튜브 고정 장치는 따뜻한 물에 마우스 꼬리를 놓을 수 있도록 높은 플랫폼 위에 배치됩니다. (C) 주입을 수행하기 직전의 마우스 꼬리 위치 및 바늘 유지 각도. 꼬리를 뒤로 당겨 꼬리가 펴지고 주입 부위가 완전히 수평이 되도록 합니다. 바늘은 꼬리와 정맥과 평행하고 경사는 위쪽을 향합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> 그림 2: IV 주입 후 형광 리포터 단백질 검출. Cre 리포터 Ai14 대립유전자를 보유하고 있는 7-9주령 수컷 마우스에 1.5 × 1012 vg/mouse의 AAV9-CMV-Cre를 160 μL(5.8-5.9 ×10 13 vg/kg) 또는 PBS로 IV를 주입했습니다. Cre IV 주입을 전달하는 AAV9 이후의 마우스 (A) 간 또는 (C) 대퇴사두근 절편의 대표적인 형광 이미지. (B) PBS 주입 마우스의 간 또는 (D) 대퇴사두근 절편을 이미지화하여 음성 대조군으로 작용했습니다. 조직을 수집하여 IV 주입 후 28일 후에 고정-냉동했습니다. Cre 노출 후, 형광 tdTomato 단백질은 형질도입된 세포 및 형질도입된 세포의 자손 세포에서 발현됩니다. 10μm 두께의 단면을 10배 배율로 이미지화했습니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> 그림 3: 이배체 게놈(vg/dg) 정량화에 따른 벡터 게놈. AAV9-CMV-Cre 또는 PBS가 주입된 마우스에서 수집된 (A) 간 조직 또는 (C) FACS 분류 세포에서 dPCR 벡터 게놈 정량화의 1D 산점도. 산점도는 양성 및 음수 dPCR 파티션과 샘플 전체의 수평선으로 표시된 검출 임계값을 보여줍니다. (B,D) (B) 간 조직 또는 (D) FACS 정렬 세포 샘플에서 마우스 이배체 게놈 및 벡터 게놈을 정량화한 후 vg/dg 정량화. 여기에 표시된 결과는 단일 AAV9 주입 마우스와 단일 PBS 주입 마우스에서 얻은 것이며 각 마우스에 대해 기술적 dPCR이 중복됩니다. 오차 막대는 각 표본에 대한 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 약어: NTC= Non-template control; dPCR = 디지털 PCR; FACS = 형광 활성화 세포 분류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>입문서</td>
			<td>순서</td>
		</tr><tr><td>Cre 포워드 프라이머</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre 리버스 프라이머</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Cre 프로브</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Polr2a 포워드 프라이머</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a 리버스 프라이머</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a 프로브</td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>표 1: vg/dg 정량화에 사용되는 프라이머 및 프로브 시퀀스. Cre 프라이머와 프로브를 사용하여 벡터 게놈을 정량화했습니다. Polr2a 프라이머와 프로브를 사용하여 마우스 이배체 게놈을 정량화했습니다.

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

출처:Pourshafie, N., et al. 설치류의 신경근 질환을 치료하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 9를 사용한 MicroRNA의 전신 전달. J. Vis. Exp. (2018).이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.

척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입

출처: Grames, MS, et al. 쥐에게 아데노 관련 바이러스의 정맥 투여 방법 및 팁 및 중추신경계 형질도입 평가. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV)의 꼬리 정맥 주사를 보여줍니다. 외측 꼬리 정맥에 주입된 후 바이러스는 혈류로 들어가 심장을 순환한 후 뇌에 도달하여 뉴런으로 들어가 신경 치료 응용을 위한 표적 단백질 생산을 촉진합니다.

 쥐 모델에서 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 정맥 투여 

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

배우세요 성체 마우스 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스 전달 방법을. 최적화된 프로토콜로 AAV 투여의 일관성과 재현성을 높여 유전자 치료 연구의 신뢰성을 향상시킵니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

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