Name: 완보동물 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 RNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 위한 단일 동물 RNA 추출법을. 동결-융해 주기와 물리적 파쇄를 활용하여 약 30% 시간 단축 및 200배 효율 향상을 달성하는 이 방법은 개별 수인동물의 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

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<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
그림 1: 단일 완보동물에서 RNA 추출을 위한 단일 튜브 파이프라인. (A) 6번의 동결-해동 주기 및 후속 cDNA 합성을 포함하여 단일 완보동물에서 RNA를 추출하기 위한 프로토콜을 보여주는 계획. 샘플은 이후에 RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용될 수 있습니다. (B) 수분 제거에 사용되는 마이크로피펫 테이퍼의 이미지. 눈금 막대 : 2mm. (C) 소량의 물에서 완보동물의 명시야 이미지 (점선). 성공적인 추출을 위해 표시된 정도까지 대부분의 수분을 제거해야 하며 용해 완충액의 희석을 방지할 수 있습니다. 눈금 막대 : 50 μm. (D) 샘플을 안전하게 빠르게 동결-해동하기 위해 긴 집게를 사용하여 샘플을 액체 질소에 담그는 모습을 보여주는 이미지. 일부 콘텐츠는 BioRender에서 제작되었습니다. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 그림 1A는 절차의 개략도를 보여줍니다. 완보동물 및 조류 배양 절차에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서 45,46,47을 참조하십시오.
1. 용천수 살균
<ol>
	<li>2갤런 물통에서 5L의 샘물을 붓습니다(자세한 내용은 재료 표 참조).</li>
	<li>오토클레이브 안전 병에 캡을 놓고 소량의 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다. 병을 조이지 마십시오. 캡을 위에 놓습니다.</li>
	<li>건조 단계 없이 습식 사이클에서 50분 동안 샘물을 오토클레이브합니다.</li>
	<li>물이 실온(RT)에 도달하도록 하고 RT에 보관하기 전에 캡을 단단히 밀봉하십시오.</li>
</ol>
2. 유리 마이크로 피펫 당기기(피펫 풀러 사용)
<ol>
	<li>유리 마이크로피펫(O.D.: 1mm, I.D.: 0.58mm, 길이: 10cm)을 마이크로피펫 풀러에 고정합니다. 가열 필라멘트와의 접촉은 피펫 모양을 변경하고 필라멘트를 손상시킬 수 있으므로 피펫 접촉을 피하십시오.<ol>
		<li>각 필라멘트와 피펫 풀러에 대해 피펫의 당김을 경험적으로 결정합니다. 그러나 최적화를 위한 시작점으로 사용하려면 78°C와 182.2g의 인장 중량의 단일 당김 단계를 사용하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>필라멘트가 가열되고 중력이 유리 마이크로피펫을 날카로운 점이 있는 두 개의 유리 마이크로피펫으로 분리하도록 합니다(그림 1B).</li>
	<li>이 뽑힌 유리 마이크로피펫을 왁스 또는 점토와 함께 밀폐된 100mm 페트리 접시에 보관하여 제자리에 고정하고 날카로운 끝이 깨지는 것을 방지하십시오.</li>
</ol>
3. 유리 마이크로피펫 당기기(피펫 풀러 없이)
<ol>
	<li>Bunsen 버너 또는 기타 제어된 화염원을 낮은 설정으로 켜십시오.</li>
	<li>양손에 한쪽 끝이 있는 유리 마이크로피펫을 가져옵니다.</li>
	<li>유리가 녹기 시작할 때까지 유리 마이크로피펫의 중앙을 화염 위로 잡습니다. 그런 다음 두 끝을 빠르게 잡아당깁니다. 이것은 두 개의 매우 섬세하고 날카로운 팁을 만듭니다.</li>
	<li>한 쌍의 멸균 된 미세한 집게로 팁을 가볍게 부러 뜨립니다.</li>
	<li>이 뽑힌 유리 마이크로피펫을 왁스 또는 점토와 함께 밀폐된 100mm 페트리 접시에 보관하여 제자리에 고정하고 날카로운 끝이 깨지는 것을 방지하십시오.</li>
</ol>
4. RNA 적출
<ol>
	<li>극저온 안전 용기에 0.5L의 액체 질소를 넣습니다. 주의 : 액체 질소는 극저온이며 피부나 눈에 노출되면 화상을 입을 수 있습니다. 취급 시에는 보호복, 스플래시 고글, 니트릴 장갑, 냉동 장갑, 실험실 가운 및 발가락이 막힌 신발을 사용하십시오. 액체를 운송하기 전에 용기가 액체 질소에 안전한지 확인하십시오. 이 단계를 위해 에탄올 드라이 아이스 수조를 사용하는 것도 가능할 수 있습니다.</li>
	<li>cDNA 합성 마스터 믹스 만들기: 1 μL의 무작위 헥사머 프라이머, 2 μL의 DNase, 4 μL의 5x RT 버퍼, 1 μL 효소 믹스, 1 μL의 H2O 및 1 μL의 10 mM dNTP를 포함하는 10 μL 용액. 이 용액을 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>완보분해 완충액(5mM Tris(pH = 8), 0.5%(v/v) 세제 1, 0.5%(v/v) 세제 2, 무균 뉴클레아제가 없는 물에서 0.25mM EDTA)를 준비합니다. 참고: 이 솔루션은 벤치 탑에 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 무균 상태를 유지하고 잠재적인 RNA 오염 소스를 피하십시오.</li>
	<li>추출을 위한 충분한 용해 완충액을 분취합니다(2 μL/완보).</li>
	<li>완보성 용해 완충액에 RNAse 억제제를 최종 농도 4 U/μL까지 첨가합니다.</li>
	<li>용액을 얼음 위에 보관하기 전에 2000 x g의 속도로 2000 x g 의 속도로 RT에서 용액을 소용돌이치고 스핀다운합니다.</li>
	<li>멸균 필터 팁 P1000 피펫을 사용하여 배양에서 실험에 필요한 만큼의 완보동물을 제거하고 멸균 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 참고: 완보동물은 이러한 방식으로 처리할 수 있습니다. 일반적으로 조건당 3개의 완보동물이 추출을 위해 처리됩니다.</li>
	<li>오토클레이브 멸균 스프링물 1mL와 멸균 필터 팁 P1000 피펫을 사용하여 완보동물을 세 번 세척합니다. 천천히 위아래로 피펫팅하면 조류 오염 물질을 제거하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>25x - 50x 배율의 해부 현미경을 사용하여 이 세척된 배양물에서 단일 완보동물을 멸균 필터 팁 P10 피펫을 사용하여 새로운 멸균 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.</li>
	<li>멸균 필터 팁 P200 피펫을 사용하여 100μL의 무멸균 뉴클레아제에서 단일 완보동물을 세척합니다. 참고: 이 세척 단계는 리보뉴클레아제를 포함한 오염 물질을 추가로 제거하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>세척된 완보동물을 멸균 필터 팁 P10 피펫을 사용하여 1-2μL의 멸균 뉴클레아제가 없는 물에 담긴 깨끗한 멸균 PCR 튜브의 바닥으로 옮기고, 완보동물이 팁 측면에 달라붙지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>완보동물을 해부 현미경으로 25배 배율로 시각화합니다.</li>
	<li>물을 쉽게 제거할 수 있도록 당겨진 유리 마이크로피펫의 끝을 튜브 바깥쪽에서 가볍게 부수십시오. 구멍이 물을 끌어올릴 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하지만 완보동물은 그렇지 않은지 확인하십시오.</li>
	<li>당겨진 유리 마이크로피펫의 모세관 작용을 사용하여 동물이 직경 약 2완보동물 길이의 작은 물방울로 둘러쌀 때까지 물을 제거합니다.</li>
	<li>해부 내시경을 통해 수분 제거 과정을 모니터링하여 수위가 적절하고 완보동물이 수분을 유지하는지 확인합니다. 참고: 그림 1C 는 예를 제공합니다.amp제거할 물의 양. 이것은 중요한 단계입니다. 완보동물이 마르는 것을 방지하기 위해 작은 물방울이 완보동물을 둘러싸지만, 용해 완충액이 희석되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 많은 과도한 물을 제거해야 합니다. 예를 들어amp잔여 수위의 경우 그림 1C를 참조하십시오.</li>
	<li>물을 제거한 직후 튜브 바닥에 완보 용해 완충액 2μL를 추가하고 잠시 와류를 일으킨 다음 탁상용 원심분리기에서 2000 x g 에서 5초 동안 상온에서 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>완보동물이 포함된 샘플을 즉시 PCR 튜브 랙에 넣고 랙으로 단단히 고정되었는지 확인합니다.</li>
	<li>한 쌍의 길고 거친 집게를 사용하여 랙을 잡고 샘플이 들어 있는 랙을 부드럽게 담그십시오.amp완전히 얼 때까지 액체 질소에 넣습니다(그림 1D).</li>
	<li>액체 질소에서 랙을 제거하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오. 샘플을 해동시킵니다(~45초에서 1분 소요). 15초마다 얼음에서 샘플을 제거하고 육안으로 검사하여 샘플을 모니터링합니다. 샘플이 눈에 띄게 투명해지면 다음 단계로 이동합니다.</li>
	<li>4.18-4.19단계를 5회 더 반복합니다. 최대 용해 및 추출을 위해 총 6번의 동결-해동 주기가 필요합니다(그림 2A, B).</li>
	<li>동결-해동이 완료되면 샘플을 얼음 위에 놓고 즉시 다음 단계로 진행합니다. cDNA 준비에 사용할 수 있는 RNA를 감소시키므로 이 시점에서 보관을 위해 샘플을 동결하지 마십시오.</li>
</ol>
5. cDNA 종합
<ol>
	<li>완보성 용해물이 포함된 PCR 튜브에 2μL의 cDNA 합성 마스터 믹스를 추가합니다. 튜브를 짧게 튕기고 탁상용 원심분리기로 2000 x g 의 RT에서 5초 동안 회전시킨 후 얼음 위에서 샘플을 교체합니다.</li>
	<li>샘플을 thermocycler에 넣고 25°C에서 10분 동안 프라이머를 어닐링하고, 55°C에서 30분 동안 배양하여 역전사를 수행하고, 마지막으로 85°C에서 5분 동안 효소를 열 비활성화합니다.</li>
	<li>배양 후 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 21μL의 무균 뉴클레아제 물을 첨가하여 샘플을 총 부피 25μL로 희석합니다. 저복제 수 전사체의 경우, 경험적으로 결정된 대로 이 희석 단계를 변경합니다.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>더 많은 양의 완보동물로부터 제조된 총 RNA를 사용하여 프라이머 세트의 어닐링 온도를 결정하고, 예를 들어, Boothby, 201843에 제시된 벌크 추출 방법을 결정합니다.</li>
	<li>qRT-PCR을 실행하기 전에 PCR 온도 구배를 실행하여 최적의 어닐링 온도를 결정합니다(이 프로토콜에 사용된 모든 PCR 설정은 표 1 및 표 2 참조).</li>
	<li>지표 염료 슈퍼 믹스 튜브 하나를 얼음에 넣고 빛으로부터 분리하십시오. 96웰 qPCR 플레이트를 얼음 위에 놓고 5μL의 슈퍼 믹스, 2μL의 물, 각 프라이머(10μM) 1μL 및 cDNA 생성물 1μL를 원하는 웰 수에 놓습니다.</li>
	<li>PCR 플레이트를 플레이트 씰로 밀봉하고 프라이머 세트에 적합한 어닐링 온도를 사용하여 qRT-PCR을 실행합니다(이 백서에 사용된 모든 qRT-PCR 설정은 표 3 참조).</li>
</ol>
7. 정량화 및 결과 해석
<ol>
	<li>결과를 하나 이상의 control housekeeping 유전자와 정량적으로 비교하며, 그 발현은 부과된 조건에 대해 일정할 것으로 예상됩니다. 이 연구를 위해 액틴 유전자를 사용했습니다.</li>
	<li>각 웰에 대한 Ct-값 또는 사이클 임계값을 구하고 대조군 하우스키핑 유전자 반응의 Ct 값과 비교합니다. 다음 방정식을 사용하여 유전자 발현의 접힘 변화를 계산합니다. 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> 참고: fold gene expression은 각 transcript 및 완보동물에 대해 2-(ΔΔCt)48로 플롯됩니다.</li>
	<li>Ct-값에서 전사 번호의 대략적인 추정치를 얻으려면 다음 방정식을 사용하십시오. 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> 여기서 N은 전사체의 수이고 2는 가정된 PCR 효율 또는 PCR48의 사이클당 형광 배증가입니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>개별 완보동물에서 qRT-PCR을 위해 최적화된 RNA 추출

<table><tbody><tr><td>10 & 마이크로; L 프리미엄 배리어 팁 낮은 바인딩, 랙, 멸균</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td>은 <td>멸균 필터 팁 P 10 피펫으로 참조됨&nbsp; 팁</td></tr><tr><td>1000 &마이크로; 엘&nbsp; 프리미엄 피펫 팁, 낮은 바인딩, 랙, 멸균</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>는 멸균 필터 팁 P 1000 피펫으로 참조됨&nbsp; 팁</td></tr><tr><td>200 & 마이크로; 엘&nbsp; 프리미엄 배리어 팁 낮은 바인딩, 랙, 멸균</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td>는 <td>멸균 필터 팁 P 200 피펫으로 참조됨&nbsp; 팁</td></tr><tr><td>4 스타 스트레이트 스트롱 미디엄 포인트 트위저&nbsp;</td><td>엑셀타&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>는 긴 집게</td></tr><tr><td>96-Well PCR Rack with Lid Assorted, 5 Racks/Unit</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td>를 <td>PCR Rack으로 지칭</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; 3M 무연 오토클레이브 테이프 1"</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>오토클레이브 테이프로 언급됨&nbsp;</td></tr><tr><td>오토클레이브 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td>은 <td>PCR 플레이트 씰로 참조</td></tr>됨 <tr><td>Benchling v8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td>는 <td>Benchling으로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell 96-Well PCR 플레이트</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>PCR 플레이트라고 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>BULWARK FR 랩 코트:&nbsp;</td><td>그레인저&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>는 실험실 코트</td></tr><tr><td>C1000 터치 바이오-라드 열순환기로 참조됨&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>Thermocycler로 불립니다.</td></tr><tr><td>C1000 터치 Bio-rad 열순환기(CFX 광학 모듈 포함)&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>qPCR 열순환기로 불립니다.</td></tr><tr><td>클로로코쿰 최면포자.&nbsp; &nbsp;</td><td>캐롤라이나</td><td>152091</td> 조류 코닝<td>으로 불립니다</td></tr><tr><td>&nbsp; PYREX 재사용 가능한 매체 저장 병</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>2L 오토클레이브 안전 유리병</td></tr><tr><td>Daigger & 회사 Vortex-Genie 2 실험실 믹서&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>3030A</td><td>는 Vortexer로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>직접-졸 마이크로 프렙&nbsp;</td><td>자이모 리서치&nbsp;</td><td>R2060</td>은 <td>RNA 추출 키트로 참조됩니다.</td></tr><tr><td>Dumont 5 생물학 핀셋</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>세밀한 집게</td></tr><tr><td>EDTA로 언급됨&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>피지 v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td>는 피펫 풀러용 <td>FIJI/ImageJ 필라멘트로 참조</td></tr>됨<tr><td>&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>는 필라멘트</td></tr><tr><td>Fisherbrand 경제 충격 고글</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td>로 언급<td>되며 스플래시 고글&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 마이크로 피펫 OD 1mm ID 0.58, 길이 10cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>유리 마이크로피펫으로 언급됨</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 균주&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>완보동물&nbsp; 또는 H. exemplaris&nbsp;</td></tr><tr><td>액체 질소 듀어 1L</td><td>한천 과학&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>냉동 안전 용기라고 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Maxima H 마이너스 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>은 cDNA 합성 마스터 믹스로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>Narishige 듀얼 스테이지 유리 마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>트라이텍 리서치</td><td>&nbsp; PC-10</td>은 <td>마이크로피펫 풀러로 언급됨&nbsp;</td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>니트릴 장갑으로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 디쉬, PS, 35/10 mm, 통풍구 포함</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>35 mm 페트리 디쉬로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash; 10 & 마이크로; L, 금속 이젝터</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>P 10 피펫</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash로 언급됩니다. 1000 &마이크로; L, 금속 이젝터</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>P 1000 피펫</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20&ndash로 언급됩니다. 200 &마이크로; L, 메탈 이젝터</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>P 200 피펫 파운드로 언급되는</td></tr><tr><td>이 4색 모델링 클레이&nbsp;</td><td>미국 과학 잉여&</td><td>nbsp; 96517P001</td><td>점토로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>프리즘 v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>는 프리즘을 참조했습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAse-Free, 8 Strip 0.2 mL PCR 튜브 with caps&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>sterile PCR tube</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease 억제제</td> Promega로 언급됨<td>&nbsp;</td><td>N2111</td>은 <td>RNAse 억제제로 지칭됨&nbsp;</td></tr><tr><td>샘물&nbsp;</td><td>Nestle Pure Life</td><td>44221229</td><td>Spring Water</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>지시자 염료 슈퍼 믹스로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>광학 및 조명이 있는 실체 현미경 시스템&nbsp;</td>해<td>부 현미경으로 언급되는</td> <td>TriTech Research</td><td>SMT1</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&nbsp; Tirrill Burners</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>Bunsen Burner로 언급됨&nbsp;</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp; DW-41-115-NEW</td>는 <td>탁상용 원심분리기로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>템프쉴드&nbsp; Cryo-Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td>는 <td>Cryo 장갑으로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>써모 사이언티픽&nbsp; Nunc 페트리 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>100mm 페트리 접시로 참조됨&nbsp;</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>트리스 또는 트리스 베이스라고 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>93443</td><td>세제 1로 참조&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>시그마 알드리치</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>세제 2로 언급</td></tr><tr><td>물 - PCR/RT-PCR 인증, 뉴클레아제가 없는</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td>은 <td>무균 뉴클레아제라고</td></tr></tbody></table> 합니다.

완보동물 hypsibius exemplaris에서 qrt-pcr을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 rna 추출

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

single-tardigrade RNA 추출의 개발 및 최적화 완보동물에서 RNA 추출을 위해 Ly et al., 201542 의 프로토콜을 채택한 STST 시스템은 제제의 양과 품질을 극대화하도록 최적화되었습니다(그림 1A). RT-PCR은 액틴 전사체에 대해 수행되었으며, 엑손 1 및 2에 걸쳐 527bp 영역을 증폭하여 전사체 수율을 정량화했습니다(이러한 프라이머에 대한 서열은 표 1에서 찾을 수 있음). 예상되는 액틴 밴드의 광학 밀도는 ImageJ/FIJI를 사용하여 형광 강도로 정량화되었습니다. 정량화된 모든 관심 영역은 각 겔에 걸쳐 동일한 면적 크기였습니다.
먼저, 완보동물의 표피를 파괴하는 데 필요한 기계적 용해 방법을 평가했습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)<sup class="...

완보동물 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 RNA 추출

The tardigrade Hypsibius exemplaris is an emerging model organism renowned for its ability to survive environmental extremes. To explore the molecular ...

single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

본 프로토콜은 실험실에서 tortricid 해충 곤충의 사육 방법을 설명합니다. 곤충의 성별을 구별하고 높은 처리량의 시퀀싱을 위해 핵산을 추출하는 절차는 두 개의 tortricid 해충을 사용하여 확립됩니다.

Tortricidae 해충 곤충의 대량 사육 및 분자 연구

학습하세요 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 위한 단일 동물 RNA 추출법을. 동결-융해 주기와 물리적 파쇄를 활용하여 약 30% 시간 단축 및 200배 효율 향상을 달성하는 이 방법은 개별 수인동물의 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

완보동물 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 RNA 추출

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