Name: Minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 5 s
Description: 학습하세요 콜라겐 기반 스캐폴드와 자가 미세이식편을 이용한 단일 단계 요로우회술 수술 모델을 Gottingen minipig에서. 이 방법은 복잡한 조직공학 절차를 단순화하여 임상 적용 가능성을 높입니다.

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저자들은 동물 수술 및 축산을 계획하고 수행하는 데 도움을 준 코펜하겐 대학의 AEM(Department of Experimental Medicine)의 직원들과 연구에 사용된 맞춤형 생분해성 스텐트를 제공한 체코 공화국의 ELLA-CS, s.r.o에 감사를 표하고자 합니다. 재정 지원은 스웨덴 의학연구협회(Swedish Society of Medical Research), 프로모빌리아 재단(Promobilia Foundation), 리드벡 재단(Rydbeck Foundation), 사마리텐 재단(Samariten Foundation), 소아 건강 관리 재단(The Foundation for Pediatric Health Care), 스톡홀름 프리무라레 반후셋(Frimurare Barnhuset) 재단, 노보 노르디스크 재단(Novo Nordisk Foundation, NNFSA170030576)에서 제공했다.

이 실험은 동물 피험자의 실험실 사용에 관한 유럽 법률에 따라 덴마크 식품 농업부(Ref. no. 2022-15-0201-01206)에서 부여한 윤리적 허가를 받은 AAALAC 인증 실험 시설에서 수행되었습니다.
1. 수술 절차
<ol><li>동물 준비<ol><li>다 자란 암컷 괴팅겐 미니피그를 수술 전 최소 12시간 동안 빠르게 만듭니다.</li>
		<li>아래 설명된 대로 모든 멸균 기구가 있는 수술 테이블을 준비합니다.</li>
		<li>다 자란 표준 크기 미니피그의 경우, 1.25mL의 케타민(100mg/mL), 6.25mL의 자일라진(20mg/mL), 1.25mL의 메타돈(10mg/mL) 및 2mL의 부토르파놀(10mg/mL)(나중에 진정 혼합물이라고 함)에 현탁된 졸라제팜 125mg과 틸레타민 125mg의 용액과 함께 1.0-1.4mL/10kg으로 근육 주사로 동물을 진정시킵니다.</li>
		<li>시각 유도 기관내 삽관을 수행합니다. 활력 징후와 눈 및 디지털 간 반사 검사로 마취를 확인합니다. 안과 연고를 양측으로 바릅니다.</li>
		<li>양측 귀 정맥 카테터를 설치하고 프로포폴(10-15mg/kg/h)과 펜타닐(5-15mg/kg/h)로 마취를 유지합니다.</li>
		<li>8 Fr 요로 카테터를 삽입하고 적절한 크기의 루어 락 주사기를 사용하여 생리학적으로 온화한 등장성 식염수 250mL를 방광에 채웁니다.</li>
		<li>돼지를 앙와위 자세로 놓고 복부를 찢어 문지릅니다. 70% 에탄올로 두 차례 더 피부를 청소한 후 멸균 드레이핑으로 수술 부위를 구성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 채취 및 외과적 골격 이식<ol><li>메스와 소작술을 사용하여 피부, 근육 및 복막을 나누고 복강 내 방광을 상처 쪽으로 당겨 표준 하부 정중선 개복술을 수행합니다.</li>
		<li>전방 방광벽에 예방적 지혈을 수행하고 2cm2 전벽 분절을 절제하여1cm2 의 근위 개구부를 남기고 나머지 방광벽을 빠르게 흡수할 수 있는 꼰 러닝 봉합사로 닫습니다.</li>
		<li>절제된 검체의 점막층을 조심스럽게 절개하고 2cm2 점막 검체를 1mm2 미세 이식편에 다져 골격 매립을 위해 만듭니다(아래 섹션 2에서 설명).</li>
		<li>스캐폴드를 완성한 후, 천천히 흡수할 수 있는 모노필라멘트 러닝 봉합사를 사용하여 전방 방광 벽의 나머지 개구부에 관 구조를 문합합니다.</li>
		<li>치골 인대의 복막 플랩을 사용하여 세뇨관 골격을 패치하고 내강 내 14 Fr 전행 결장 관장(ACE) 스토퍼를 세뇨관 골격에 삽입합니다.</li>
		<li>소변이 새는 것을 방지하기 위해 천천히 흡수되는 4-0 모노필라멘트 봉합사로 도관의 말단부를 결찰하고 방광 카테터를 통해 주사기로 총 250mL의 멸균 식염수를 주입하여 문합 개통을 확인합니다.</li>
		<li>경근막(trans-fascial channel)을 정중선(midline)에서 측면으로, 우측의 꼬리 유선(caudal mammary gland)에서 2-3cm를 둔하게 절개하고, 도관을 피하 포켓에 넣습니다. 원위 도관을 두 개의 경피적 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 고정하여 피부 수준에서 위치를 표시합니다.</li>
		<li>천천히 흡수할 수 있는 모노필라멘트 러닝 봉합사로 복부 근육의 전방 근육 근막을 닫고, 빠르게 흡수할 수 있는 꼰 러닝 봉합사로 피하를 조정하고, 비흡수성 모노필라멘트 러닝 봉합사로 피부를 닫습니다.</li>
		<li>마취를 중단한 후 동물을 발관하고 완전히 보행할 수 있고 안전하게 마시고 먹을 수 있을 때까지 마구간에서 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 비계 건설
<ol><li>복합 스캐폴드의 준비<ol><li>수술 전(최대 2시간) 앞서 설명한 대로 쥐꼬리 콜라겐 I형의 액체 용액을 준비합니다17. 간단히 말해서, 콜라겐 용액에 4:1의 10x 최소 필수 매체(MEM)를 추가하고 1M NaOH로 pH를 7.4로 근사화한 다음 마지막으로 1x MEM을 추가하여 최종 콜라겐 농도 1.64mg/mL를 목표로 합니다. 나중에 사용할 때까지 용액을 멸균 바이알에 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>외과적 조직 절제 및 다진 후에는 겸자를 사용하여 점막 입자(즉, 미세 이식편)를 1:6 팽창률(예: 2cm2 점막 조직이 12cm2 메쉬로 확장됨)로 2cm x 6cm 장착된 생분해성 메쉬에 수동으로 놓습니다.</li>
		<li>멸균 강판 위에 1cm x 3cm x 6cm(높이 x 너비 x 길이) 크기의 멸균 직사각형 강철 금형을 준비하고 미세 이식편이 위쪽을 향하도록 메쉬를 강철 금형에 넣습니다. 콜라겐 용액 20mL를 금형에 부드럽게 붓고 메쉬에서 미세 이식편이 씻겨 내려가지 않도록 합니다. 전체 구조물을 38°C 멸균 가열 챔버로 옮기고 5분 동안 응고시킵니다.</li>
		<li>충분히 응고시킨 후 구멍이 뚫린 강판 위에 놓인 나일론 메쉬에 하이드로겔을 밀어 넣고 금형을 부드럽게 제거합니다.</li>
		<li>겔 위에 나일론 메쉬를 놓고 강판을 올려 하이드로겔에서 수분을 배출한 다음 강판 위에 120g의 무게(이 경우 매립에 사용된 강철 주형에 해당)로 5분 동안 수동적으로 압축합니다.</li>
		<li>압박 후, 납작한 지지체를 생분해성 스텐트 주위로 굴리고, 5cm x 0.6cm(길이 x 내경) 크기의 미세 이식편을 스텐트를 향하게 하고, 천천히 흡수되는 모노필라멘트 러닝 봉합사로 골격을 세로로 봉합합니다. 완성된 도관은 이제 외과적 이식 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 수술 후 관리
<ol><li>진통 및 항생제 예방<ol><li>처음 3일 동안은 부프레노르핀(0.05-0.1 mg/kg/8시간 정맥 주사), 처음 4일 동안은 멜록시캠(0.4 mg/kg/일 근육 주사 또는 경구), 트리메토프림(2.7 mg/kg/일 근육 주사 또는 4.2 mg/kg/일 경구) 및 설파독신(13.3 mg/kg/일 근육 주사 또는 20.8 mg/kg/일 경구) 투여합니다. 수술 후 동물이 아직 마취된 상태에서 근육 주사를 투여합니다.</li>
		<li>외부 정맥 카테터와 봉합사 재료를 갉아먹는 것을 피하기 위해 동물을 단독으로 사육합니다. 플렉시 유리 창을 통해 이웃 minipigs와 시각적 접촉을 제공하고 펜 사이의 접촉 가능성을 제공합니다. 매일 신선한 짚과 건초, 장난감과 물을 제공하고 매일 두 번 먹이 를 제공합니다.</li>
		<li>동물의 자연스러운 행동, 식습관, 소변 및 대변 생성을 매일 모니터링하고 매주 체중을 평가합니다.</li>
		<li>관찰 기간(6주)이 끝나면 진정 혼합물의 1-1.4mL/10kg 근육 주사로 동물을 진정시키고 치명적인 펜토바르비탈 주사(100mg/kg 정맥 주사)로 동물을 종결합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 사후 평가
<ol><li>총 해부학<ol><li>종단 후 피부 높이에서 원위 도관을 절개하고 ACE 스토퍼를 제거합니다. 플라스틱 클램프로 요도를 닫고 카테터를 사용하여 원위 도관 입구를 통해 등장성 식염수에 아이오헥솔의 1:20 조영제 용액 250mL를 주입합니다.</li>
		<li>64슬라이스 컴퓨터 단층 촬영 스캐너로 동물을 평가합니다. 다중 평면 재구성을 사용하여 이미지를 시각화하고 의료 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지를 분석합니다.</li>
		<li>본래 요도를 통해 16.2 Fr flexible cystoscope를 사용하여 방광과 도관 lumina의 내시경 검사를 수행합니다.</li>
		<li>도관을 절제하면서 총체적인 해부학적 소견을 신중하게 평가합니다. 또한 도관 문합에 2cm 여유를 두고 전체 벽 방광 생검을 절제하고 참조 값에 대해 유사한 방식으로 처리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직학적 처리<ol><li>절제된 검체를 24시간 동안 10% 포르말린으로 고정합니다.</li>
		<li>메스로 도관을 직각으로 근위부, 내측 및 원위 도관 세그먼트의 동일한 크기의 개별 섹션으로 나눕니다. 증가된 에탄올 농도로 표본을 탈수하고 마이크로톰 절단 전에 파라핀에 삽입합니다.</li>
		<li>헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 판시토케라틴 CK-AE로 5μm 절편을 염색하고 디지털 조직학 슬라이드 스캐너로 스캔합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

돼지의 1단계 요로 전환 수술을 위한 콜라겐 골격 접근

<ol><li>Surer, I., Ferrer, F. A., Baker, L. A., Gearhart, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continent+urinary+diversion+and+the+exstrophy-epispadias+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Continent urinary diversion and the exstrophy-epispadias complex.</a> J Urol. 169 (3), 1102-1105 (2003).</li>
<li>Cranidis, A., Nestoridis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Bladder augmentation.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).</li>
<li>Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+gastric+augmentation+on+bladder+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of gastric augmentation on bladder function.</a> J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).</li>
<li>Husmann, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+following+augmentation+cystoplasty%3A+A+transitional+urologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Urol%22%5BJournal%5D)">Mortality following augmentation cystoplasty: A transitional urologist's viewpoint.</a> J Pediatr Urol. 13 (4), 358-364 (2017).</li>
<li>Mitrofanoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-appendicular+continent+cystostomy+in+the+management+of+the+neurogenic+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Chir+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Trans-appendicular continent cystostomy in the management of the neurogenic bladder.</a> Chir Pediatr. 21 (4), 297-305 (1980).</li>
<li>Leslie, B., Lorenzo, A. J., Moore, K., Farhat, W. A., Bägli, D. J., Pippi Salle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+followup+and+time+to+event+outcome+analysis+of+continent+catheterizable+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Long-term followup and time to event outcome analysis of continent catheterizable channels.</a> J Urol. 185 (6), 2298-2302 (2011).</li>
<li>Horst, M., Eberli, D., Gobet, R., Salemi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+in+pediatric+bladder+reconstruction-The+road+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering in pediatric bladder reconstruction-The road to success.</a> Front Pediatr. 7, 91(2019).</li>
<li>Ajalloueian, F., Lemon, G., Hilborn, J., Chronakis, I. S., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+biomechanics+and+the+use+of+scaffolds+for+regenerative+medicine+in+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Uro%22%5BJournal%5D)">Bladder biomechanics and the use of scaffolds for regenerative medicine in the urinary bladder.</a> Nat Rev Uro. 15 (3), 155-174 (2018).</li>
<li>Dorin, R. P., Pohl, H. G., De Filippo, R. E., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubularized+urethral+replacement+with+unseeded+matrices%3A+what+is+the+maximum+distance+for+normal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Uro%22%5BJournal%5D)">Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration.</a> World J Uro. 26 (4), 323-326 (2008).</li>
<li>El Kassaby, A. W., AbouShwareb, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+comparative+study+between+buccal+mucosal+and+acellular+bladder+matrix+grafts+in+complex+anterior+urethral+strictures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Randomized comparative study between buccal mucosal and acellular bladder matrix grafts in complex anterior urethral strictures.</a> J Urol. 179 (4), 1432-1436 (2008).</li>
<li>Casarin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+submucosa+%28SIS%29+as+a+suitable+scaffold+for+the+creation+of+a+tissue-engineered+urinary+conduit%3A+Decellularization%2C+biomechanical+and+biocompatibility+characterization+using+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal submucosa (SIS) as a suitable scaffold for the creation of a tissue-engineered urinary conduit: Decellularization, biomechanical and biocompatibility characterization using new approaches.</a> Int J Mol Sci. 23 (5), 2826(2022).</li>
<li>Casarin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+hybrid+membrane+for+urinary+conduit+substitutes+based+on+small+intestinal+submucosa+coupled+with+two+synthetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">A novel hybrid membrane for urinary conduit substitutes based on small intestinal submucosa coupled with two synthetic polymers.</a> J Funct Biomater. 13 (4), 222(2022).</li>
<li>Drewa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+artificial+conduit+for+urinary+diversion+in+rats%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">The artificial conduit for urinary diversion in rats: a preliminary study.</a> Transplant Proc. 39 (5), 1647-1651 (2007).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+tubular+graft+for+urinary+diversion+after+radical+cystectomy+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered tubular graft for urinary diversion after radical cystectomy in rabbits.</a> J Surg Res. 182 (2), 185-191 (2013).</li>
<li>Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+minced+bladder+mucosa+for+a+one-step+reconstruction+of+a+tissue+engineered+bladder+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit.</a> Biomed Res Int. 2013, 212734(2013).</li>
<li>Ajalloueian, F., Nikogeorgos, N., Ajalloueian, A., Fossum, M., Lee, S., Chronakis, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressed+collagen+constructs+with+optimized+mechanical+properties+and+cell+interactions+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Compressed collagen constructs with optimized mechanical properties and cell interactions for tissue engineering applications.</a> Int J Biol Macromol. 108, 158-166 (2018).</li>
<li>Chamorro, C. I., Zeiai, S., Engberg, G. R., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minced+tissue+in+compressed+collagen%3A+A+cell-containing+biotransplant+for+single-staged+reconstructive+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minced tissue in compressed collagen: A cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair.</a> J Vis Exp. (108), e53061(2016).</li>
<li>Juul, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+cellular+behavior+and+micromolecular+communication+in+urothelial+micrografts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Insights into cellular behavior and micromolecular communication in urothelial micrografts.</a> Sci Rep. 13 (1), 13589(2023).</li>
<li>Reinfeldt Engberg, G., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+submucosal+bladder+wall+tissue+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Expansion of submucosal bladder wall tissue in vitro and in vivo.</a> Biomed Res Int. 2016, 5415012(2016).</li>
<li>Juul, N., Ajalloueian, F., Willacy, O., Chamorro, C. I., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+autologous+urothelial+micrografting+and+composite+tubular+grafts+for+future+single-staged+urogenital+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Advancing autologous urothelial micrografting and composite tubular grafts for future single-staged urogenital reconstructions.</a> Sci Rep. 13 (1), 15584(2023).</li>
<li>Willacy, O., Juul, N., Taouzlak, L., Chamorro, C. I., Ajallouiean, F., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perioperative+layered+autologous+tissue+expansion+graft+for+hollow+organ+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">A perioperative layered autologous tissue expansion graft for hollow organ repair.</a> Heliyon. 10 (3), e25275(2024).</li>
<li>Chamorro, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+concept+of+in+vivo+guided+tissue+engineering+by+a+single-stage+surgical+procedure+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring the concept of in vivo guided tissue engineering by a single-stage surgical procedure in a rodent model.</a> Int J Mol Sci. 23 (20), 12703(2022).</li>
<li>Casarin, M., Morlacco, A., Dal Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+substitution%3A+The+role+of+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Process%22%5BJournal%5D)">Bladder substitution: The role of tissue engineering and biomaterials.</a> Process. 9 (9), 1643(2021).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 미래의 재건 수술을 위한 간단하고 접근하기 쉬운 기술을 제시합니다. 자가 세포 확장을 포함한 조직 공학의 일반적인 단점은 외과적 이식 전에 비용이 많이 들고 상당한 준비 단계가 필요하다는 것입니다. 자가 미세이식은 이러한 많은 단계를 단순화할 수 있으며 잠재적으로 단일 단계 절차를 허용할 수 있습니다. 복잡한 조직학적 개체를 자동 이식함으로써, pro-regenerative paracrine 신호전달이 유도된다18. 이전 연구에서 우리는 미세이식편만으로는 스캐폴드에 적절하게 부착되지 않는 한 물리적 환경에 취약하다는 것을 경험했습니다15,19. 콜라겐은 체외에서 조직 확장을 위한 실행 가능한 환경으로 연구되어 왔으며 유리한 생체 적합성과 상업적 가용성으로 인해 우리의 목적에 맞게 선택되었습니다. 여기에 제시된 복합 스캐폴드는 이전에 미세 이식편 임베딩 및 콜라겐 농도20,21,22의 변화를 평가하는 시험관 내 실험 중에 최적화되었습니다. in vivo 테스트 전에 투과성, 생체 역학 및 분해에 관한 스캐폴드 특성이 in vitro20에서 평가되었습니다. 또한, in vivo 스캐폴드 기반 조직 확장은 설치류 및 토끼 모델21,22에서 이전에 검증되었습니다.
수술 모델은 소아 또는 청소년 환자의 신경인성 방광 기능 장애에 대한 요로 전환의 임상 환경을 모방하여 골격의 관 버전을 평가하기 위해 선택되었습니다. 중요한 단계에는 점막 미세이식편의 정확한 절개와 절제 시점부터 골격 매립까지 습한 환경을 유지하는 것이 포함됩니다. 또 다른 중요한 단계에는 적절한 하이드로겔 응고가 포함됩니다. 콜라겐을 조심스럽게 피펫팅하면 겔 내에 기포가 형성되지 않고 올바른 온도 설정과 구성 용액을 통해 겔이 적절하게 응고되도록 합니다. 응고된 겔을 얻지 못하면 콜라겐 박리와 미세 이식편 박리의 위험이 증가합니다. 수술 부분의 경우, 기계적 외상이나 해리로 인한 미세이식편이 손상되지 않도록 이식 중 신중한 취급이 중요합니다. 복부를 닫기 전에 방광에 액체를 주입하여 체액 개통을 주의 깊게 해결해야 합니다.
이 기술의 한계에는 스캐폴드의 두께가 포함되며, 이는 직관적으로 외부 환경에서 미세 이식편으로의 영양소 확산과 관련하여 상한을 가지고 있습니다. 반면에, 스캐폴드 두께의 감소는 부적절하게 높은 투과성과 소변 누출로 이어질 수 있습니다. 우리의 현재 구성은 다양한 콜라겐 농도의 세포 재생을 비교한 이전의 시험관 내 평가를 기반으로 합니다20. 자가 조직의 미세이식술은 또한 건강한 이식 조직에 의존하기 때문에 현재의 시술은 암성 재이식의 위험을 적절하게 배제할 수 없는 악성 질환에 적합하지 않다23; 그럼에도 불구하고 현재 기술은 위험으로 간주되지 않는 기능적 배뇨 장애가 있는 경우를 위해 설계되었습니다. 이 모델은 임상 환경(즉, 충수장 절제술 절차)의 여러 단계를 모방하지만, 이 실험은 도관이 원위부로 결찰되어 있기 때문에 요로 전환을 위해 완전히 기능하는 장(요)루를 활용하지 않습니다. 또한 임상적 합병증은 평생 동안 발생할 수 있으므로 6주간의 관찰 기간은 협착 및 요실금에 대한 특정 결과에 대한 제한된 지식을 제공할 수 있습니다. 따라서 치유된 도관을 피부 수준으로 문합한 후 추가 6개월 추적 관찰을 연구에 추가할 수 있습니다.
이 기술의 관점은 단순한 설계와 관련이 있으며, 미세 이식 조직 기원 및 지지 생체 재료가 다른 관련 대안으로 대체되는 경우 보편적인 응용 분야를 가능하게 합니다. 이러한 구성 요소는 골격 강도, 탄성 및 생분해와 관련된 장기 특정 목적에 맞게 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 접근하기 쉽고 저렴한 비용으로 인해 재현성이 뛰어나고 기술의 번역이 확대될 수 있습니다.

비뇨생식기 기형의 경우, 기능적 해부학적 구조를 복원하기 위해 재건 수술이 필요할 수 있으며, 종종 중요한 적응증에 따라 1,2. 기존의 외과적 접근법은 기형이거나 누락된 장기를 재건하기 위해 다른 장기 시스템(예: 위장관)의 고유 조직을 활용했습니다. 그러나 종종 심각한 수술 후 합병증의 위험이 있습니다 3,4. 장기간의 카테터 삽입이 필요한 신경인성 방광 기능 장애 환자를 위한 요로 전환의 경우, 충수 또는 재조정된 소장 분절이 요로 도관을 구성하는 데 자주 사용됩니다 5,6. 조직 공학은 장기 특이적 특성을 충족하도록 맞춤화할 수 있는 대체 이식 조직을 제공하여 환자의 수술 후 이환율을 최소화합니다 7,8. 다양한 종류의 골격은 그 자체로 이식될 수 있는 반면, 가급적이면 자가 세포를 이용한 추가적인 골격 세포화는 이식 후 재생 결과를 향상시키는 것으로 나타났습니다 9,10,11,12,13,14. 그럼에도 불구하고 조직 공학적 스캐폴드는 종종 복잡하고 비용이 많이 드는 구성 요소로 구성되며, 둘째, 체외 세포 배양 및 스캐폴드 파종에 대한 요구 사항은 힘들고 자원 집약적입니다. 이러한 요인들은 이 분야에서 수십 년간의 연구에도 불구하고 조직 공학 골격의 임상 번역을 방해했습니다. 복잡성과 금전적, 물질적 요구 사항을 줄임으로써 조직 공학 골격은 희귀 절차와 더 일반적인 절차를 모두 다루는 현대 수술에 광범위하게 구현될 수 있습니다.
콜라겐은 이전에 세포 확장을 위한 실행 가능한 플랫폼으로 확립되었으며, 더욱이 외과적 이식을 위해 세포 또는 조직을 골격에 부착할 때 유리한 생체 접착제로 작용합니다 15,16,17. 수술 전후 자가 미세 이식은 1차 시술 중에 관심 조직을 채취하고 직접 재이식함으로써 체외 세포 배양의 필요성을 우회합니다. 절제된 조직을 더 작은 입자로 다져냄으로써, 표면적 및 성장 잠재력이 증가되어, 스캐폴드(18) 상에 더 큰 팽창 비율을 허용한다. 콜라겐 기반 골격은 비뇨생식기 재건술에 특별히 부착되지는 않지만 이론적으로 여러 중공 장기 재건 부위에 적용할 수 있습니다.
이 원고에서는 콜라겐과 내장된 자가 요로상피 미세이식편을 결합한 관형 골격 구축을 위한 프로토콜과 in vivo 골격의 기술적 타당성 및 안전성, 재생 성능을 평가하는 minipig 모델을 제시합니다. 이 모델은 여기에 제시된 프로토콜과 방법을 사용하여 10마리의 다 자란 암컷 미니피그에서 평가되었습니다. 스캐폴드의 주요 장점은 구조물의 단순성과 단일 단계 이식으로 환자가 여러 후속 수술 절차를 거치지 않아도 된다는 것입니다. 이 절차는 일반 외과 인력이 기존 수술 환경에서 수행할 수 있으며 표준 장비와 재료가 필요합니다. 동물 모델은 임플란트를 연구하기 위한 통제된 환경을 허용하면서 동물이 즉시 정상적인 행동으로 돌아가는 동시에 골격 및 절차에 변형을 구현할 수 있는 추가 가능성을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US</td><td>2517592</td><td>콜라겐 제제</td></tr><tr><td>1x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US</td><td>2508924</td><td>콜라겐 제제</td></tr><tr><td>Ambu aScope 4 Cysto</td><td>Ambu A/S, Ballerup, DK</td><td>1000682507</td><td>Cystoscope</td></tr><tr><td>Aquaflush ACE 스토퍼</td><td>Abena, Taastrup, DK</td><td>ACE12/220501</td><td>ACE 스토퍼</td></tr><tr><td>Borgal 수의사 inj opl 200 + 40 mg/mL</td><td>Ceva Animal Health A/S</td><td>510460</td><td>Sulfonamide/Trimethoprim</td></tr><tr><td>Bupaq multidose vet 0.3 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 502763 <td>Buprenorphin</td></tr><tr><td>Butomidor 수의사 inj 10 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 531943 <td>Buthorphanol</td></tr><tr><td>Comfortan 수의사 inj 10 mg/mL</td><td>Dechra 수의학 제품 A/S, DK</td><td></td> 492312 <td>Metadone</td></tr><tr><td>Ethilon 봉합사 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & 존슨, 뉴 브런 즈윅, 미국</td><td>SGBCXV</td><td>모노 필라멘트 비 흡수성</td></tr><tr><td>펜타닐 inj 50 &micro; g/mL(하멜)</td><td>Hameln Pharma ApS, DK</td><td>432520</td><td>펜타닐</td></tr><tr><td>케타도르 수의사 inj 100 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 115727 <td>케타민</td></tr><tr><td>Metacam inj 20 mg/mL t.cattle/pig/horse</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>6443</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Metacam 구강 현탁액 15 mg/mL 돼지</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>482780</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Omnipaque</td><td>GF Healthcare, 오슬로</td><td>16173849</td>, <td>CT</td></tr><tr><td>Pancytokeratin CK-AE</td><td>DAKO Agilent, US</td><td>GA053</td><td>클론 AE1/AE3</td></tr><tr><td>PDS 봉합사 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US</td><td>SEMMTQ</td><td>모노필라멘트 저속 흡수성</td></tr><tr><td>프롤렌 봉합사 4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US</td><td>PGH187</td><td>모노필라멘트 비흡수성</td></tr><tr><td>Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL</td><td>Fresenius Kabi, DK</td><td>21636</td><td>Propofol</td></tr><tr><td>Rat-tail collagen type I</td><td>First Link Ltd, Wolverhampton, UK</td><td>60-30-810</td><td>0.6% 아세트산 내 2.06 mg/mL 단백질</td></tr><tr><td>Suprim vet&nbsp; 20 + 100 mg (음용수에 사용하기 위한 용액)</td><td>Dechra Veterinary Products A/S, DK</td><td>33661</td><td>Sulfonamide/Trimethoprim</td></tr><tr><td>SX-ELLA 분해성 담즙 DV 스텐트</td><td>ELLA-CS, Trebes, CZ</td><td>S23000056-01</td><td>&oslash; 6mm x 60mm</td></tr><tr><td>Vicryl 메쉬</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US</td><td>VM1208</td><td>Mesh</td></tr><tr><td>Vicryl 봉합사 4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US</td><td>SMBDGDR0</td><td>꼰 빠른 흡수성</td></tr><tr><td>Xysol 수의사 inj 20 mg/mL</td><td>ScanVet Animal Health A/S, DK</td><td>54899</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL</td><td>Virbac Danmark A/S, DK</td><td></td> 568527 <td>틸레타민 및 Zolazepam</td></tr></tbody></table>

minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델

Surgical Model for Single-Staged Tissue-Engineered Urothelial Tubes in Minipigs

재건 수술은 종종 이식 조직의 부족으로 어려움을 겪습니다. 비뇨생식기 기형 치료에서 기존의 솔루션은 환자의 정상적인 기능을 회복하기 위해 풍부하기 때문에 비기압성 재건을 위해 위장관 조직을 채취하는 것이었습니다. 신체 내 토착 조직을 재배열한 후의 임상 결과는 종종 심각한 이환율과 관련이 있습니다. 따라서 조직 공학은 이 외과 분야에서 특정 잠재력을 가지고 있습니다. 상당한 발전에도 불구하고 조직 공학 골격은 주로 재료, 생산 및 이식에 대한 비싸고 복잡한 요구 사항 때문에 유효한 수술 치료 대안으로 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜에서는 요로 전환을 위한 도관으로 설계된 자가 장기 특이적 조직 입자가 내장된 간단하고 접근 가능한 콜라겐 기반 관형 스캐폴드를 제시합니다. 골격은 1차 수술 절차 중에 구성되며 일반적으로 사용 가능한 수술 재료로 구성되며 기존의 수술 기술이 필요합니다. 둘째, 프로토콜은 이식 후 단기적인 in vivo 결과를 평가하도록 설계된 동물 모델을 설명하며, 절차에 추가적인 변형이 있을 수 있습니다. 이 간행물은 자가 조직과 관 형태의 사용에 특별한 주의를 기울여 절차를 단계별로 시연하는 것을 목표로 합니다.

이 연구에서는 생체 내 요로상피 조직 확장이 콜라겐 기반 세뇨관 골격에서 이루어집니다. 수술 전후에 채취 및 처리된 자가 조직 입자로 골격을 삽입함으로써 이 절차는 수술 후 면역억제 치료를 병행할 필요 없이 단일 단계 골격 이식을 가능하게 합니다. 외과적 치료는 생분해성 메쉬와 스텐트로 골격을 강화함으로써 가능합니다(그림 1). 6주간의 관찰 후, 거시적 조직 평가에서 숙주 거부 반응이나 감염의 징후가 나타나지 않았으며, 관형 골격은 특허적이고 장애물이 없는 것으로 나타났습니다(그림 2). 조직학적 평가에서 요로상피 기원의 성층화된 발광 상피가 골격 전체를 덮고 있는 것으로 보이며 강화 생체 재료의 잔해는 6주 후에도 여전히 볼 수 있습니다(그림 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig01.jpg"> 그림 1: 스캐폴드 구성 및 주입. 방광 조직은 수술 전후에 절개됩니다(왼쪽 상단). 다진 점막 미세이식편은 수술용 메쉬(상단 중앙)로 확장되고 응고된 콜라겐(오른쪽 상단)에 삽입됩니다. 콜라겐을 압박하여 수분을 배출하고 스텐트를 준비합니다(왼쪽 아래). 스캐폴드는 스텐트 주위에 관형으로 형성되고 ACE 스토퍼는 스텐트 내부(하단 중앙)에 배치됩니다. 방광은 부분적으로 닫혀 있고, 구조물은 최종적으로 조직 절제의 원래 부위(오른쪽 아래)에서 방광에 통합됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig02.jpg"> 그림 2: 스캐폴드 거시적 평가. 6주 후, 동물은 안락사되고 골격(화살표)은 피부 수준(왼쪽 상단)에서 절개됩니다. 방광은 조영제(노란색)로 채워지고 CT 스캔을 수행하여 도관(화살표)의 개통성 및 협착 형성 징후(오른쪽 상단)를 평가합니다. 방광경 검사는 요도를 통해 6주 후(왼쪽 아래) 방광과 문합(화살표)을 평가하기 위해 수행됩니다. 도관은 외부 개구부를 통해 카테터(화살표)를 삽입하고 방광(오른쪽 하단)에 삽입하여 개통성을 다시 한 번 테스트합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig03.jpg"> 그림 3: 스캐폴드 현미경 평가. 절제된 도관을 고정하고 직교 횡단면을 수행하여 근위-원위 방향의 도관을 평가합니다. 6주 후, 도관 내강(1)을 평가하여 상피화(확대된 상단)를 확인합니다. 생분해성 스텐트(2)와 메쉬 재료(확대된 바닥)의 잔해는 이 시점에서 여전히 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

재건 수술을 위한 조직 공학 임플란트는 복잡하고 값비싼 골격 구성 요소를 포함하는 힘든 체외 배양으로 인해 전임상 시험 이상으로 거의 진행되지 않습니다. 여기에서는 자가 미세이식편을 포함하는 접근 가능한 콜라겐 기반 관형 골격을 사용하여 요로 전환을 위해 설계된 단일 단계 절차를 제시합니다.

Minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델

Reconstructive surgeries are often challenged by a lack of grafting tissue. In the treatment of urogenital malformations, the conventional solution has ...

surgical-model-for-single-staged-tissue-engineered-urothelial-tubes

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

방광 종양은 catheterization, 지역 소작하고, 화상 사이트에 암종 세포의 후속 유착을 통해 법으로서 방식으로 여성의 생쥐에 설립되었습니다.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

비가역적 편측성 요관 폐색(unlateral ureteric obstruction, UUO)의 쥐 모델(murine model)은 절단된 요관을 방광으로 문합하여 요관 폐색이 완화되는 가역적 UUO 모델과 함께 제시됩니다. 이러한 모델은 신장 염증 및 흉터뿐만 아니라 조직 리모델링에 대한 연구를 가능하게 합니다.

돌이킬 수 및 가역 일방적 Ureteric 폐색의 쥐 모델

이 연구는 자유롭게 움직이는 마우스에서 깨어있는 낭종 측정법을 수행하기위한 수술 절차 및 실험 기술을 설명합니다. 또한 최적화 및 표준화를 지원하는 실험적 증거를 제공합니다.

마우스 모델에서 깨어나는 방광 측정을 수행하기위한 절차 평가

본 프로토콜에서는 Wistar 쥐에서 요도 협착 유도가 개발되었고, 협측 점막 이식편을 통한 요도 재건이 뒤따랐습니다. 역행성 요도 조영술 및 레이저 도플러 평가를 수행하여 요도 재건(협착 형성 후) 및 이식편 배치를 검증했습니다.

쥐 모델에서 협측 점막 이식편 요도 성형술에 이은 요도 협착 유도

본 프로토콜은 편측 요관 폐색의 단계적이고 재현 가능한 모델을 설명합니다.

가역적 일방적 요관 폐색의 미성숙한 쥐 모델(An Immature Murine Model of Reversible Unilateral Ureteral Obstruction)

이 글은 요도하 이식편 재료를 테스트하기 위해 고안된 새로운 동물 모델에 대해 설명합니다. 이 모델에서는 암양의 질 절개를 통해 메쉬 테이프를 이식하고 3개월 동안 동물을 관찰합니다. 이 모델은 이식편에 대한 실험적 연구의 토대를 마련하기 때문에 필수적입니다.

요도하 이식편을 위한 양 모델의 새로운 수술 기법

이 연구는 바이아트리방 기술을 활용하여 Bama 미니어처 돼지에서 전임상 정소성 심장 이식 모델을 제안합니다. 이 모델은 이식 면역학, 약물 평가 및 수술 기술 최적화에 적용할 수 있으며 임상 심장 이식 응용 분야를 지원합니다.

Biatrial 기술을 사용한 Bama 미니어처 돼지의 정형외과성 심장 이식의 전임상 모델

절차는 지방과 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용하여 기계적 성질의 비침 투 현지 심사를 통해 osteogenic 조직 공학 구조의 공학 결과를 모니터링하기위한 자기 공명 elastography의 방법론을 보여줍니다.

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

폴리머 밸브 개발에 관심이 갱신되었습니다. 여기서 목적은 트라이 전단지 형상을 수용하고 가까운 동일한 조건에서 수집 된 네이티브 및 인공 밸브 데이터에 비해 폴리머 밸브 유체 역학적 데이터를 제시하는 프로토콜을 정의하는 상업 펄스 복제기를 수정의 타당성을 입증하는 것입니다.

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