SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

우리의 연구는 멤브레인 수송의 특성과 기능, 특히 LRRC8 형성 음이온 및 삼투압 채널과 같은 이온 수송체 및 채널에 중점을 둡니다. 우리는 그들의 생물물리학적 메커니즘, 조절 과정 및 세포 생리학적 기능을 조사합니다. 결국, 우리는 또한 그들의 기능 장애가 어떻게 인간에게 장애로 이어질 수 있는지 밝히는 것을 목표로 합니다.

많은 연구실에서 LRRC 채널에 대한 이해를 높이고, LRRC8 복합체의 구조를 분해하고, 전기생리학적 특성을 설명하고, 다양한 생리학적 역할을 밝혔습니다. 그러나 이러한 채널은 어떻게 생화학적으로나 생리학적으로 조절되며 소단위 구성이 세포 내에서 활성화와 역할에 어떤 영향을 미치는지에 대한 중요한 질문이 남아 있습니다. 이 방법을 사용하면 전체 세포 패치 클램프와 같은 세포질 구성을 방해하지 않고 세포 내 구획과 같은 전기 생리학에 일반적으로 액세스할 수 없는 구획에서 LRRC8 채널 활동을 관찰할 수 있습니다.

세포 내 해상도를 통해 단일 세포 내에서 차등적으로 활성화된 LRRC8 채널을 모니터링할 수 있으며 생리학적 과정 중에 지속적인 모니터링이 가능합니다. 이 FRET 기반 센서를 사용하여 다양한 생리학적 조건에서 LRRC8 VRAC 채널의 조절 및 기능을 조사할 것입니다. 핵심 질문은 다음과 같습니다. 어떤 신호 전달 과정이 다른 자극과 관련되어 있는지, 그리고 LRRC8의 다른 paralogs 사이에 차이점이 있는지 여부; 그리고 생리학적 과정에 세포 내 차이가 있는지 여부.

먼저 등장성 완충액, 저장성 완충액, 고긴장성 완충액을 준비합니다. 삼투압계를 사용하여 버퍼의 삼투압을 측정합니다. 형질 주입 전날, 35mm 접시에 2ml의 세포 배양 배지에 5개의 HeLa 세포의 1배를 1배로 파종합니다.

세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 적가형으로, 접시에 나선형 동작으로 transfection 용액을 추가합니다. 접시를 벤치 표면에서 수평 및 수직으로 5회 이동하여 용액을 혼합합니다.

세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 형광 현미경으로 transfection을 확인합니다. donor와 acceptor constructs를 모두 발현하는 세포를 취하여 세포 배양 배지를 흡인합니다.

2ml의 등장성 완충액으로 세포를 세 번 씻습니다. 등장성 완충액을 흡인시킨 후 세포에 3ml의 등장성 완충액을 추가하고 샘플 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 현미경 FRET 설정을 로드하거나 FRET 실험에 필요한 채널을 설정합니다: donor excitation-donor emission, DD;donor-acceptor, DA; 및 수용체-수용체, AA. donor 및 acceptor 구성을 모두 표현하는 cell이 하나 이상 있는 field of view를 찾고 필요한 경우 채널 설정을 조정합니다.

현미경 스테이지에서 플레이트를 제거하고 실험이 진행될 때까지 인큐베이터에 다시 넣습니다. 공여자만 발현하는 세포를 취하여 배양액을 구성하고 흡인합니다. 2ml의 등장성 완충액으로 세포를 세 번 씻습니다.

마지막 세척 후 세포에 3ml의 등장성 완충액을 추가하고 샘플 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. donor construct를 발현하는 cell이 하나 이상 있는 field of view를 찾습니다. 모든 기증자-기증자, 수용자-수용자 및 기증자-수용자 채널을 이미지화합니다.

세포 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그리고 공여자-수용자 및 공여자-공여자자 채널의 평균 강도를 측정합니다. 배경 빼기의 경우, 배경 신호만 발견되는 donor-acceptor 및 donor-donor 채널에서 ROI를 그리고 평균 intensity를 측정합니다. 세포를 이미징한 후 세포 주위에 ROI를 그리고 donor-acceptor 및 acceptor-acceptor 채널의 평균 강도를 측정합니다.

배경 빼기를 위해 배경 신호만 발견되는 도너-수용자 및 수용자-수용자 채널에서 ROI를 그리고 평균 강도를 측정합니다. 마지막으로, background-corrected IDA, background-corrected IDD 및 background corrected IAA에 대해 결정된 값을 사용하여 보정 계수 beta 및 gamma를 계산합니다. 시작하려면 공여자와 수용체를 발현하는 이전에 준비된 HeLa 세포에서 완충액을 흡인합니다.

3ml의 등장계 완충액으로 세포를 세척하고 샘플 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 등장성 완충액의 흡인을 위해 호스 캐뉼라를 고정하고 조정하여 끝이 접시 바닥에 도달하도록 합니다. 완충액을 추가하려면 중력 구동 완충액 흐름이 접시로 떨어질 수 있도록 튜브를 고정하고 조정하십시오.

donor와 acceptor 구조체를 동시에 발현하는 cell이 하나 이상 있는 field of view를 찾고 이미지를 획득합니다. FRET 신호에 대한 배경 빼기의 경우, 배경 신호만 발견되는 도너-수용체 채널에 ROI를 그리고 평균 강도를 측정합니다. SE-FRET 정량화를 위해 세포 주위에 ROI를 그리고 시계열의 모든 이미지에 대한 donor-donor, donor-acceptor 및 acceptor-acceptor 채널의 평균 강도를 측정합니다.

자극 시퀀스의 모든 조건을 다루기 위해 10초 간격과 지속 시간으로 채널 donor-donor, donor-acceptor 및 acceptor-acceptor에 대한 타임랩스 실험을 설정합니다. 타임랩스 이미징 획득을 시작하고 SE-FRET 트레이스를 플로팅합니다. 기준선 측정 후 버퍼를 중력 흐름으로 교체합니다.

실제 실험에서는 호스 캐뉼라를 통해 등장성 완충액을 흡인하고 주사기로 진공을 적용합니다. 저속 이미징을 계속하는 동안 중력 흐름에 의해 다음 조건의 완충액 3ml를 추가합니다. 다른 상태를 측정하려면 시간 경과 이미징을 계속하는 동안 이전에 표시된 대로 다음 버퍼에서 샘플을 세척합니다.

FRET 기반 방법을 사용하여 삼투압 자극 및 SE-FRET 감소와 세포 외 긴장저하와 상관관계가 있는 동안 부피 조절 LRRC8 음이온 채널의 활성을 모니터링했습니다. 다른 실험에서는 디아실글리세롤 신호 전달 또는 근세포 활성화와 같은 동방성 자극에 의한 LRRC8 VRAC 활성화도 검출되었습니다. LRRC8A mCerulean3 및 LRRC8E mVenus를 발현하는 HeLa 세포에서 세포사멸 유도 시 LRRC8 VRAC 활성을 모니터링했습니다.

종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha)와 시클로헥시미드(cycloheximide)는 강력한 SE-FRET 감소를 일으켰으며, 이는 긴장성 매체에서 회복되었습니다. DMSO 처리는 SE-FRET을 감소시키지 않아 LRRC8 VRAC에 대한 특이성을 확인했습니다.