Name: SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 SE-FRET 기반 방법으로 HeLa 세포에서 LRRC8/VRAC 이온 채널 활성을 실시간 모니터링하는 기술을. 삼투압 변화에 따른 채널 조절 메커니즘을 비침습적으로 연구할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>전기생리학 없이 LRRC8 채널 활성을 모니터링하는 FRET 기반 방법

8 (LRRC8) 계열 단백질을 포함하는 류신이 풍부한 반복의 이질체로 구성된 이온 채널은 척추 동물 세포 전체에서 발견되며 광범위한 생리적 기능에 참여합니다 1,2. 이러한 LRRC8 채널은 처음에 부피 조절 음이온 채널(VRAC) 또는 부피에 민감한 외부 정류 채널(VSOR)로 확인되었으며 세포 조절 부피 감소에 중요한 역할을 합니다 3,4. 그들은 염화물 이온과 유기 삼투압의 배출을 촉진하며, 이는 삼투압 팽창에 대한 반응으로 물 유출을 뒤따릅니다. 삼투압 스트레스 반응에서의 역할 외에도 세포 부피 조절에 대한 역할은 세포 증식 및 이동, 세포사멸, 정자 형성 및 상피 무결성과 관련이 있습니다 5,6,7. LRRC8/VRAC 활성화 시 막 전위의 변화는 췌장 β세포에 의한 근관 분화8 및 인슐린 분비에 기여하는 것으로 나타났습니다 9,10,11. 더욱이, LRRC8 채널은 퓨린성 신호 분자 ATP 및 cGAMP 또는 흥분성 아미노산 글루타메이트와 같은 다양한 유기 삼투압을 전도하여 면역 체계 또는 신경교-뉴런 상호 작용12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. 염료 플루오레세인(dye fluorescein), 항생제 블라스티시딘 S 또는 항암제 시스플라틴(cisplatin)과 같은 생체이물조차도 LRRC8 채널23,24,25에 의해 수행됩니다.
LRRC8/VRAC 활성화로 이어지는 신호 전달에 대한 수많은 보고가 있습니다 26,27,28. 그러나 그 메커니즘은 불분명하며, 문헌은 특정 생리학적 과정에 의존할 수 있는 광범위한 잠재적 메커니즘을 제시합니다. 여기에는 세포질 이온 강도의 변화, 세포골격과의 상호 작용, 막 구성, G 단백질, 산화 환원 상태 및 인산화 폭포 2,27,29,30,31의 변화가 포함됩니다.
LRRC8/VRAC 채널은 생리학적으로 기능적인 채널 4,14,32를 형성하기 위해 패러로그 LRRC8B-E 중 적어도 하나와 이질중합되어야 하는 필수 서브유닛 3,4로 LRRC8A를 포함합니다. 소단위 조성은 정류 및 탈분극 의존적 불활성화 4,29,32,33,34, 기질 특이성 15,17,20,21,24,35 및 일부 활성화 경로36,37과 같은 채널의 생물물리학적 특성을 결정합니다. 초저온 전자 현미경 (Cryo-EM) 구조는 LRRC8A 동질체와 이질체가 헥사머 38,39,40으로 조립되는 반면, 기능 채널을 형성하는 LRRC8A / LRRC8C 키메라는 헵타머41로 조립됨을 보여줍니다. 모든 LRRC8 단백질의 N-말단 부분은 4개의 막관통 나선으로 구성되며, C-말단 부분은 류신이 풍부한 반복(LRRD)이 있는 도메인을 포함합니다. 이용 가능한 LRRC8 복합 구조는 세포질 3,4,23으로 뻗어 있는 LRRD가 채널 게이팅 34,42,43 동안 구조적 재배열을 겪을 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 개념은 형광 단백질의 C-말단 융합이 기저 채널 활성(14)을 유발하고 나노바디를 도메인에 결합하면 채널 활성(44)을 조절할 수 있다는 발견에 의해 뒷받침됩니다. 더욱이, C-termini의 구조적 변화는 intra-complex Förster 공명 에너지 전달(FRET)45에 의해 나타났습니다.
이온 채널 활성을 연구하는 가장 일반적인 방법은 전기생리학적 측정(electrophysiological measurement)46이며, 이는 분자 식별(molecular identification)47 전에 VRAC의 조사에 광범위하게 적용되었습니다. 그러나 VRAC 활동을 간접적으로 모니터링할 수 있는 다양한 추가 방법이 있으며, 여기에는 전도성 기질(할로겐화물 이온 또는 유기 삼투압)의 측정 또는 세포 부피48에 미치는 영향을 포함합니다. 실제로, LRRC8 단백질을 VRAC로 식별하는 것은 활성화된 VRAC 3,4를 통해 세포에 들어가는 요오드화물에 의한 할로겐화물에 민감한 형광 단백질49의 담금질에 기초한 분석에 의존했습니다. LRRC8/VRAC 채널 활성을 모니터링하는 또 다른 방법은 FRET45의 변화에 의해 다른 이온 채널 50,51,52,53에서와 같이 관찰할 수 있는 세포질 도메인의 움직임을 사용합니다. 이를 위해 청록색-형광 단백질(CFP)/mCerulean3을 공여체로, 황색-형광 단백질(YFP)/mVenus를 수용체로 사용하여 FRET 쌍 역할을 하는 형광 단백질을 LRRC8 단백질의 C-말단에 융합했습니다(그림 1). LRRC8 소단위 사이의 복합 내 FRET는 수용체 광표백 실험45에 의해 나타났습니다. 파괴적인 광표백 방법을 피하기 위해, 시간 경과에 따른 FRET 변화는 sensitized-emission FRET(SE-FRET)에 의해 모니터링되었으며, 여기서 기본적으로 공여자의 방출 스펙트럼과 수용체의 여기 스펙트럼의 겹침으로 인한 공여자의 여기 시 수용체의 감작 방출이 측정됩니다. LRRC8/VRAC 활성화를 위한 자극인 세포외 긴장저하증을 적용하면 SE-FRET 강도가 가역적으로 감소했다45. 중요한 것은, 저장성 치료 중 전세포 패치-클램프 측정과 FRET 모니터링을 동시에 실시한 결과, FRET의 감소가 실제로 LRRC8/VRAC 활성화와 유사하다는 것을 보여주었다45. 피펫 용액에 의한 원형질막의 파괴 또는 세포 내 환경의 변경을 방지하는 이 방법은 LRRC8/VRAC 활성을 모니터링하기 위한 대안을 제공합니다. 네이티브 세포질을 유지하는 것이 중요하거나, 세포 내 해상도가 필요하거나, 채널 활성을 장기간 관찰해야 하는 생리학적 환경에서 특히 유용합니다.
여기에서는 이러한 FRET 기반 판독으로 LRRC8/VRAC를 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 세포를 처리 및 transfection하고, 샘플을 획득하여 이미지를 제어하고, 데이터를 분석하고, SE-FRET(sensitized emission FRET) 값을 계산하는 방법을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
그림 1: LRRC8 FRET 쌍 시스템의 개략도. mCerulean3는 청록색으로, mVenus는 노란색으로 표시됩니다. VRAC 개방 후 형광단 사이의 거리(및/또는 공간 방향)가 변경되어 공여체(Don)와 수용체(Acc) 사이의 에너지 전달이 감소하고 관찰된 FRET가 낮아집니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>카메라 DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td> 해당 <td>없음</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; C.F. Kaminski (University of Cambridge, UK)</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터 휠(460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS(소 태아 혈청)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>필터 큐브 CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시 35mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>포유류 자궁 경부 암종 / Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (염화칼륨)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>광원 LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>로고 biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>로고 biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (염화마그네슘)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>현미경 THUNDER Imager live cell</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (염화나트륨)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈 HC PL APO 63x/1.40 오일</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계 OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신(펜 스텝)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>종양 괴사 인자 (TNF) - a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>밸브 제어 중력 관류 시스템</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

se-fret(sensitized-emission förster resonance energy transfer)를 사용하여 8채널(lrrc8/vrac) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

이 FRET 기반 방법을 사용하면 삼투압 자극 중에 LRRC8/VRAC 활성을 모니터링할 수 있으며 SE-FRET의 감소는 세포 외 긴장저하도의 정도와 상관관계가 있습니다45. 긴장저하로 인한 채널 활성화에 대한 대표적인 결과도 여기에 나와 있습니다(그림 3 및 그림 4). 또한, 디아실글리세롤 신호전달45 의 조작 또는 근세포 활성화56 동안과 같은 다양한 동방성 자극에 의한 LRRC8/VRAC 활성화를 관찰할 수 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
그림 4: SE-FRET 추적. (A) 5개의 독립적인 실험에서 나타난 명백한 SE-FRET 추적. 데이터는 시야(FOV)당 ± 셀의 N = 2에서 N = 7개의 SD를 나타냅니다. (B) 모든 셀의 평균 ± SD(N = 31 셀). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
LRRC8/VRAC 채널은 또한 세포사멸 부피 감소24,57에 관여하기 때문에, 세포사멸 유도 시 채널 활동을 관찰하는 것은 여기에 설명된 방법에 대한 또 다른 응용이 될 것입니다. 이에 따라 LRRC8A-mCerulean3 및 LRRC8E-mVenus를 발현하는 HeLa 세포에서 SE-FRET을 모니터링하기 위한 프로토콜은 사멸 수용체 매개 세포사멸 유도 약물을 적용하면서 수행되었습니다. 종양괴사인자(TNF)-α와 시클로헥시미드(CHX)는 이전에 몇 분 이내에 VRAC 전류를 유발하는 것으로 나타났다58. 등장성 완충액에 2ng/mL TNF-α 및 1μg/mL CHX를 첨가한 후 SE-FRET가 크게 감소했습니다(그림 5). 완충액을 긴장성 매질로 대체하면 TNF-α와 CHX가 포함되어 있음에도 불구하고 SE-FRET 값이 기준선에 가깝게 회복되었으며(그림 5A), 이는 세포사멸 유도 Fas 리간드로 치료하는 동안 긴장성 수용액에서 VRAC 전류가 감소하는 것과 일치합니다58. TNF-α 및 CHX의 용매인 DMSO로 세포를 처리한 결과 SE-FRET가 감소하지 않았습니다. TNF-α + CHX는 FRET 제어59로 EYFP 및 ECFP 탠덤 구성물인 CFP-18aa-YFP의 SE-FRET에 영향을 미치지 않았으며, 이는 LRRC8/VRAC에 대한 특이성을 입증했습니다(그림 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
그림 5: 사멸 수용체 매개 세포사멸에 의한 등방성 VRAC 활성화. (A) 시간 경과에 따른 HeLa 세포(n = 8개 접시, 23개 세포)를 발현하는 LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen의 정규화된 SE-FRET 값. 등장성 이미징 버퍼(기준선)에서 15회 후, 수조 용액을 30회 주기 동안 2ng/mL TNF-α 및 1μg/mL 시클로헥시미드(CHX)가 보충된 등장성 완충액으로 교체한 후 TNF-α 및 CHX가 포함된 20회 주기의 긴장성 이미징 완충액으로 교체했습니다. 각 ROI 및 시점의 원시 평균 SE-FRET 값은 각 ROI에 대한 기준선(isotonic) 값의 평균으로 정규화되었습니다. (B) CHX(n = 5개 접시, 12개 세포)에 대한 비히클 제어로 DMSO를 포함하는 등장성 용액 또는 A(n = 8개 접시, 23개 세포)와 같이 세포사멸 유도제를 포함하는 등장성 완충액 또는 세포사멸 유도자(n = 3개 접시, 9개 세포)로 CFP-18aa-YFP를 발현하는 HeLa 세포의 A에서와 같이 LRRC8A/E를 발현하는 HeLa 세포의 정규화된 SE-FRET 값의 정량화. 데이터는 개별 셀(기호)의 각 버퍼에 있는 마지막 10개 시점의 평균과 SD에 ± 모든 셀의 평균을 나타냅니다. ** p &lt; 0.01 일반 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 사후 검정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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