허혈성 뇌졸중 후 아급성 및 만성 시기에 형질도입된 세포에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 AAV 시스템 및 마우스 모델

우리는 허혈성 뇌졸중의 잠재적 치료법으로 신경인성 전사 인자의 AAV 매개 이소성 발현을 연구하고 있습니다. 우리의 초점은 뇌졸중 후 아급성 및 만성 단계에서 GFAP 발현 세포의 Neurod1 발현이 형질도입된 뉴런을 증가시키고 운동 기능 개선과 상관관계가 있는지 확인하는 것입니다. 최근의 연구 결과에 따르면 피질의 유전자 발현은 동일한 AAV를 가진 지역에 따라 다르다는 것을 보여줍니다.본 연구는 GFAP 프로모터가 운동 피질보다 내측 전전두엽 피질에서 더 활발하다는 것을 발견했으며, 이는 형질도입된 세포가 특정 프로모터에 다르게 반응한다는 것을 나타냅니다.

따라서 신경인성 전사 인자와 관련된 치료법은 표적 뇌 영역에 맞게 조정되어야 합니다. 현재 직면한 과제는 ET-1의 주입 속도 및 뇌 영역 간 전달 효율과 같은 변수로 인한 뇌졸중 병변 크기의 변동성을 포함합니다. 뇌 영역과 마우스 균주 전반에 걸친 AAV 역가 및 영양성은 transduction efficiency에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 뇌졸중 후 이소성 Neurod1 발현의 세포 평가에 영향을 미칠 수 있습니다.

성상세포를 뉴런으로 전환하는 데 있어 주요 과제는 재프로그래밍된 뉴런을 기존 뉴런과 구별하는 것입니다. 우리 연구실은 새로운 도구를 개발하여 이러한 재프로그래밍이 생체 내에서 발생하는지 확인하는 것을 목표로 합니다. 궁극적으로, 우리는 신경 세포 전사 인자의 이소성 발현이 뇌 손상 동물의 회복을 어떻게 향상시키는지 이해하려고 합니다.

시작하려면 챔버에서 마취된 동물을 제거하고 깨끗한 표면에 놓습니다. 마우스의 수술 부위를 청소한 후 입위 노즈콘에 코를 놓고 이어바를 사용하여 두개골을 안정화합니다. 숫자 10 메스 날을 사용하여 눈의 중간 지점 뒤에서 두정골까지 시상면과 평행하게 수직 절개를 만듭니다.

그런 다음 피부를 부드럽게 집어넣어 두개골을 드러냅니다. 다음으로, Q-tip을 사용하여 두개골의 근막을 파괴하고 두개골을 건조시켜 브레그마를 완전히 노출시킵니다. 고속 입체 드릴을 사용하여 오른쪽 감각 운동 피질의 좌표에 세 개의 버 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 드릴을 길이가 0.375인치인 바늘이 장착된 26게이지 주사기로 교체합니다. 멸균 PBS에 용해된 1.5마이크로리터의 400마이크로몰 엔도텔린-1 용액을 주사기에 로드합니다. 소량의 엔도텔린-1을 방출하여 바늘 끝에서 물방울이 떨어지는 것을 관찰하여 좋은 흐름을 보장합니다.

경막에 구멍을 뚫지 않고 두개골을 지나 중간 버 구멍으로 바늘 끝을 내립니다. 정렬되면 바늘을 뇌 쪽으로 1mm 내립니다. 해밀턴 주사기를 사용하여 한 번에 0.1마이크로리터를 분주하고 1분 동안 기다렸다가 다음 0.1마이크로리터를 주입합니다.

주사 사이와 주사 후에 바늘이 막히는 것을 방지하려면 바늘 끝에 방울이 나타날 때까지 소량의 엔도텔린-1을 방출합니다. 멸균 Q-tip을 사용하여 주입하기 전에 과도한 엔도텔린-1을 닦아냅니다. 마지막으로, 상처를 봉합하기 위해 4-0 멸균 봉합사를 사용하여 두개골의 위에 있는 피부를 봉합합니다.

엔도텔린-1 처리된 마우스를 마취한 후 마우스를 입위 프레임으로 옮깁니다. 수술용 가위를 사용하여 상처의 봉합사를 자릅니다. 집게로 딱지를 제거하고 피부를 수축시켜 두개골을 드러냅니다.

그런 다음 멸균 Q-tip을 사용하여 두개골 표면을 건조시키고 버 구멍을 찾습니다. 입체택시 장치의 매니퓰레이터 암을 설정합니다. 길이가 0.375인치인 바늘이 있는 26게이지 주사기가 있는 바늘 홀더를 놓습니다.

이제 3.4마이크로리터의 AAV 용액을 주사기에 넣습니다. 바늘 끝을 두개골을 지나 첫 번째, 가장 앞쪽에 있는 버 구멍으로 내립니다. 바늘이 경막을 뚫지 않는지 확인한 다음 뇌 속으로 1mm씩 내립니다.

Hamilton 주사기를 사용하여 앞에서 설명한 것처럼 한 번에 0.1마이크로리터를 분주하여 1마이크로리터의 AAV 용액을 주입합니다. 그런 다음 두개골의 위에 있는 피부를 봉합하여 4-0 폴리소브 폴리에스테르 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다. 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 회수 구역의 깨끗하고 예열된 동물 사육장으로 옮깁니다.