Name: 체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 배우세요 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 기술을 활용한 Th17 세포 분화 연구 방법입니다. 원발성 T세포에서 유전자 표적화를 통해 면역 반응 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Th17 분화에서 유전자 편집을 위한 가이드 RNA의 레트로바이러스 형질도입

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 m EDTA (pH 8.0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 세포 및 조직 배양 접시</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (Free Acid, sterile)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>24-well cell and tissue culture plate</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48-well cell and tissue culture plate</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin 용액 (1,000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 항체 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e 단클론 항체 (145-2C11), 기능 등급, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 단클론 항체 (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) 단클론 항체 (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 (40 &mu; m)</td><td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기(70 &mu; m)</td><td><a name="범위! B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>5425&nbsp; R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR 마스터 믹스</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II 원스텝 클로닝 키트</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; 유능한 세포</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini Plasmid Kit II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect 트랜스펙션 시약</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 프리미엄 플러스</td><td>Gibco A5669701</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 IL-17A 항체 (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA 와이퍼?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>마우스 GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM 감소 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>감소 혈청 매체</td></tr><tr><td>Pacific Blue 안티 마우스 CD4 항체 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 항체 (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 항체 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 마우스&nbsp;</td><td>상하이 모델 유기체 센터</td><td>Cat. NO. NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-베타 1 (CHO 발현) 단백질, CF</td><td>R & D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>연구 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>연구 세포 분류기</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 중간</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp 열 순환기 PCR 시스템</td><td>응용 Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산 용액 (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 항체 (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-&gamma; 항체 (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 항체 (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 항체 (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

체외(in vitro)의 th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 crispr/cas9 매개 유전자 표적화

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

이 연구에서는 sgRNA 타겟을 Rorc에 복제하고 sgRNA-비표적 코딩 염기서열을 mCherry 형광 단백질이 있는 pMX-U6-MCS 벡터에 복제했습니다(그림 1A,B). 레트로바이러스 생산은 그림 2에 요약된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. transfection은 0일째에 시작되었고, 레트로바이러스 수확은 2일에 이루어졌다. transfection 효율은 mCherry 형광 강도로 테스트할 수 있습니다(그림 1C). 바이러스를 채취하기 전에 naive CD4+ T 세포를 분류하고 활성화했습니다. 그런 다음 이러한 활성화된 CD4+ T 세포를 스핀 감염을 사용하여 감염시킨 후 설명된 대로 분화 단계를 계속했습니다. 마지막으로, 형질도입의 효율성과 분화 결과는 유세포 분석 및 qPCR 분석을 사용하여 평가되었습니다.
그림 3은 naive CD4+ T cell을 분류하기 위해 적용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. 주세포 집단과 단일항 세포를 선택한 후(그림 3의 처음 두 게이트에서 볼 수 있듯이), FVD-CD4+ 세포를 게이팅하여 Th17로 편광된 CD4 T 세포와 APC의 세포를 구별했습니다. 마지막으로, CD4 T 세포에 의해 생성된 IL-17A는 Th17 분화 효율을 나타내며, 이는 녹아웃 효율을 나타냅니다. mCherry 양성 세포의 비율은 레트로바이러스 감염의 효율성을 반영하며, 녹아웃 효율은 IL-17A 양성 세포의 비율로 표시됩니다. 세포 생존력을 높이고 분류 기간을 최소화하기 위해 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트를 사용하여 비장세포를 농축하여 90%를 초과하는 농축 효율을 달성했습니다.
mCherry 양성 세포의 존재로 나타나는 레트로바이러스 감염의 효율은 일반적으로 약 40%입니다(그림 4A). 바이러스 농도를 통해 감염 효율을 높일 수 있지만, 이 접근 방식은 실험 기간이 길어지고 비용이 많이 듭니다. 본 실험에서 Th17 세포 분화 칵테일 없이 배양된 감염된 세포는 Th0로 지정된 Th17 분화 음성 대조군 역할을 했습니다. 비표적 sgRNA를 sgNT라고 하는 positive control로 사용했습니다. 유전자 편집을 위해 RORγt 유전자를 표적으로 하는 gRNA(sgRNA-Rorc)를 사용하여 Th17 분화 효율을 크게 줄였습니다(그림 4A). 이러한 개입은 또한 Rorc 및 IL-17a 의 발현 수준을 크게 감소시켰습니다(그림 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
그림 1: 레트로바이러스 벡터로 sub-clone된 sgRNA의 예 및 transfection 효율. pMX-U6-MCS 벡터가 초기 구조로 사용되었습니다. gRNA 스캐폴드는 (A) 스크램블 부위 및 (B) Rorc를 표적으로 하는 sgRNA 염기서열(주황색 부분)과 함께 U6 promoter(U6 프라이머로 염기서열분석을 위한 섹션으로서의 녹색 부분)의 다운스트림에 삽입되었습니다. sgRNA 함유 프라이머 및 염기서열분석 프라이머 부위의 위치는 원형 벡터 아래에 표시되어 있으며, 플라스미드에 있는 약어의 전체 이름은 다음과 같습니다. 약어: AmpR = 암피실린, 카르베니실린 및 관련 항생제에 대한 내성; LTR = 긴 단자 반복; MMLVψ = Moloney murine leukemia virus의 패키징 신호; gag = 시작 코돈이 없는 잘린 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 개그 유전자. (C) 플라스미드 DNA 형질 주입된 Plat-E 세포에서 mCherry의 현미경 이미징. 눈금 막대: 500픽셀. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
그림 2: 프로토콜의 개략도. transfection 전날에는 Plat-E 세포의 밀도를 적절한 범위로 조정해야 합니다. 다음날(0일)에 transfection을 수행하고 12시간 후에 배지를 교체합니다. 1일차에 Cas9 발현 마우스의 naive T cell을 분류하고 활성화합니다. 그 후(2일차), 바이러스 함유 배양 상등액을 수확하고 활성화된 T 세포와 결합하여 레트로바이러스 형질도입을 수행합니다. 그런 다음 감염된 세포를 3-4일 동안 Th17 세포로 분화하고 FACS를 사용하여 분석합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
그림 3: CD4 naive T cell을 분류하기 위한 게이팅 전략. CD4, CD25, CD44 및 CD62L을 표지하기 위해 농축된 CD4 T 세포에 표면 염색을 수행했습니다. 사용된 게이팅 전략은 다음과 같습니다: 초기에 림프구는 전방 산란 및 측면 산란 매개변수를 기반으로 게이트되었습니다. 그 후, FSC-H 및 FSC-W를 사용하여 단일 세포를 식별했습니다. 그런 다음 CD4 + CD25- 세포를 게이트하여 조절 T 세포 (Tregs)를 배제했습니다. 마지막으로, CD44낮은CD62L높은 naive T 세포가 확인되었습니다. 분리된 CD4+ naive T cell은 후속 실험을 위해 수집되었습니다. 약어: FSC = 전방 산란; SSC = 측면 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
그림 4: 활성화된 T 세포의 성공적인 형질도입 및 Th17 분화의 예. (A) Th17의 분화 효율은 RORγt gRNA(mCherry+ IL-17a+population에 대한 게이팅)에 의해 편집되는 현저히 감소합니다. (B) Th0(Th17 세포 분화 칵테일 없이 배양된 감염된 세포), sgNT(비표적 sgRNA) 및 sgRNA-Rorc( RORγt 유전자를 표적으로 하는 sgRNA)에서 Rorγt 및 IL-17a 상대 mRNA 발현. p &lt; 0.001 (짝을 이루지 않은 양측 학생의 t-검정, 데이터는 SEM± 평균으로 제공됨). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">PCR 반응 성분</td>
			<td colspan="4">PCR 프로그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>부피(μL)</td>
			<td>걸음</td>
			<td>임시 직원.</td>
			<td>시간</td>
			<td>주기</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × 판타 믹스 (염료 플러스)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15들</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>프라이머-F(10μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15들</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">프라이머-R(10μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 분 30 초</td>
			<td>2단계로 이동합니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>템플릿(~30ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: PCR 반응 구성 요소 및 gRNA 벡터 구축을 위한 PCR 프로그램.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

retroviral-crisprcas9-mediated-gene-targeting-for-study-th17

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

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공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

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CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

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마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

배우세요 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 기술을 활용한 Th17 세포 분화 연구 방법입니다. 원발성 T세포에서 유전자 표적화를 통해 면역 반응 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

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