Name: Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 다공성 기판 전기천공법과 상피 전기 임피던스 측정을 결합한 고효율 세포 전달 기술. 이 방법은 세포 생존율을 유지하며 중간 단계 과정을 실시간으로 분석하여 최적의 펄스 파라미터를 식별합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>A431 세포의 전기천공법 분석 및 전달 예측을 위한 TEEI 방법

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

전기천공법은 세포를 전기장에 노출시켜 단백질, RNA 및 DNA를 포함한 화물이 1,2를 통과할 수 있는 세포막에 임시 기공을 만드는 기술입니다. 가장 널리 사용되는 버전은 벌크 전기 천공법(BEP)입니다. BEP는 수백만 개의 세포를 포함하는 전해질로 큐벳을 채우고, 전해질을 고전압에 노출시키고, 화물이 확산 또는 세포내이입(endocytosis)을 통해 세포로 들어갈 수 있도록 하여 수행됩니다1. BEP에는 높은 처리량과 수많은 상업적으로 이용 가능한 시스템을 포함하여 많은 이점이 있습니다. 그러나 BEP 전달에는 제한이 있습니다. 전극에 대한 일관되지 않은 셀 위치 및 인접 셀로부터의 전기장 차폐는 BEP 3,4 동안 전기장 노출에 상당한 변동성을 유발합니다. BEP에 필요한 고전압은 또한 세포 생존력에 상당한 부정적인 영향을 미친다5. 20116 년에 시작된 이래로 PSEP (porous substrate electroporation)라는 전기 천공법 방법에 대한 관심이 높아지고 있지만, 국소 전기 천공법 및 나노 또는 마이크로 전기 천공법 1,7,8을 포함한 다른 이름으로 불리기도 합니다. BEP의 세포 현탁액과 달리 PSEP는 다공성 기판에 부착된 세포에서 수행됩니다. 부착 상태는 인간 세포주(9)의 대다수에 대해 선호될 뿐만 아니라, 기질 내의 기공은 또한 전류에 초점을 맞추어, 세포막(10,11)의 특정 영역으로 막횡단 전위(TMP)를 국소화한다. 이러한 국소화를 통해 인가 전압을 크게 줄여 손상을 줄이며 세포 생존율을 높일 수 있습니다. 이러한 효과의 조합은 세포막 공극 발달을 제어하여 보다 일관되고 효율적인 전달을 가능하게 합니다 1,5,12.
최근 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 다공성 멤브레인 인서트(13)(그림 1A,B)를 고정하기 위한 6웰, 금도금 전극 어레이가 있는 PSEP 장치를 소개했으며, 이는 Vindis et al.14에 의해 처음 소개된 관행입니다. 이 장치는 펄스를 적용하고 경상피 전기 임피던스(TEEI)로 알려진 세포 단층 전체에 걸쳐 전기 임피던스를 실시간으로 측정할 수 있습니다13. 장치의 사용자 인터페이스를 통해 electroporation 파형 및 극성을 완벽하게 제어할 수 있습니다. 중요한 것은 실시간 임피던스 측정을 사용하여 값비싼 시약이나 형광 마커 없이도 전달 결과를 예측할 수 있다는 것인데, 이는 무표지 전달로 알려진 개념입니다15.
PSEP 플랫폼은 펄스 발생기 및 TEEI 측정 장비를 수용하는 장치 본체와 다공성 기판이 삽입되고 전기천공이 발생하는 전극 어레이의 두 가지 주요 맞춤형 전기 부품으로 구성됩니다. 모든 맞춤형 전자 장치 및 3D 프린팅 구성 요소에 대한 다이어그램은 GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI 에서 찾을 수 있습니다. 맞춤형 전자 장치 외에도 플랫폼이 제대로 작동하려면 컴퓨터도 필요합니다. 사용자 지정 소프트웨어를 사용하려면 MATLAB(버전 2021a 이상)을 실행하고 분석을 위해 데이터를 저장하고 액세스하려면 Microsoft Excel이 필요합니다. 이 프로그램은 맞춤형 전자 장치를 제어하고 설정 조정을 위한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공합니다. 이러한 프로그램은 GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI 에서도 사용할 수 있습니다.
예비 데이터에 따르면 이 과정은 다양한 유형의 부착 세포에 대해 가능하지만(그림 1C), 이 기사에서는 Brooks et al.13에 의해 이 세포주에 대해 최적으로 발견된 매개변수를 사용하여 A431 세포를 준비하는 방법에 대해서만 설명합니다. 또한 프로피듐 요오드화물(PI) 화물은 세포독성이 있기 때문에 두 가지 실험이 수행되는데, 첫 번째는 전달 효율성을 정량화하기 위해 고농도 PI transfection 배지를 사용하고, 두 번째는 장기간에 걸쳐 TEEI를 측정하기 위해 세포 배양 배지만 사용합니다. 이러한 실험은 동일한 전기천공법 파형을 사용하여 결과를 상호 연관시킬 수 있습니다(그림 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> 그림 1: 전극 어레이 조립 다이어그램 및 기본 데이터. (A) 전극 어레이의 웰 내부 인서트의 CAD 모델. (B) 전극 어레이의 CAD 모델. (C) 선택한 세포주에 대한 PSEP로 인한 임피던스 증가, 세포주당 n = 3. 오차 막대: 평균의 표준 오차입니다. (D) 배송 효율성 vs. TEEI는 상관 관계 데이터를 증가시킵니다. 전달 효율은 전달 실험의 PI 및 calcein 이미지에 라벨링된 세포의 수를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 셀 수는 맞춤형 CellProfiler 파이프라인(전압당 n = 6)을 사용하여 측정되었습니다. 오차 막대: (x축 및 y축) 평균의 표준 오차입니다. 이 그림은 Brooks et al.13 의 허가를 받아 복제한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>15mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>2칩 일회용 혈구계</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 구성 요소</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>일회용 원심 분리기 튜브 (50mL)</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>유체 흡인 시스템</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>인간 플라즈마 Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 200 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (0.2-2 &micro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00002</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (100-1000 &마이크로; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (20-200 &마이크로; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (2-20 &마이크로; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Reaction Tube 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24-well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0.4 & 마이크로; M 기공 직경, 2x106 cm-2 기공 밀도, 투명 PET</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트(24-well)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

transepithelial electrical impedance monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

주어진 프로토콜은 TEEI 측정을 사용하여 전기천공법의 중간 프로세스를 검사하고 특히 A431 세포주 및 PI 화물에 대한 배송 예측을 수행하는 방법을 설정합니다. 이 프로토콜의 수정은 이 기사에서 더 자세히 논의되지만 특정 값은 변경될 수 있지만 응답의 일반적인 추세는 일관되게 유지된다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 초기 기준선 아래로 떨어지는 TEEI 데이터는 세포 사멸에 해당하고, 최소값을 초과하는 TEEI 값의 최대 증가는 전달 효율13에 해당합니다. 이러한 일반적인 추세와 그 의미는 아래에서 살펴봅니다.
그림 2A에서 볼 수 있듯이 PSEP 플랫폼을 사용하는 동안 다양한 TEEI 측정 및 세포 이미징 추세가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 이상적인 결과는 그림 2Ai에 표시된 최적화된 정상 데이터와 유사한 곡선을 생성하는 것입니다. 이는 기준선 이하로 떨어지지 않기 때문에 이상적인 결과로 특징지어지며, 이는 세포 사멸이 거의 없음을 나타냅니다. 또한, 최적화된 건강 곡선은 TEEI가 최소값에서 가장 크게 증가하여 높은 수준의 전달 효율성을 나타냅니다13. 이러한 추론은 세포 단층의 PSEP 후 이미징에 의해 뒷받침되며, 이는 무시할 수 있는 세포 사멸과 건강하고 완전히 합류하는 세포 단층을 보여줍니다(그림 2Aiii). 또한, 동일한 PSEP 파형을 사용한 성공적인 전달 실험은 그림 2B에 표시된 이미지로 특성화할 수 있습니다. 적절한 electroporation 파형 적용 및 화물 농도는 높은 수준의 배송 일관성과 셀 생존력을 제공합니다.
세포 단층의 건강 및 밀도는 TEEI 기반 전달 예측의 성공적인 적용에 매우 중요합니다16,17. 최적화된 파형을 사용하더라도 비정상적이거나 불완전한 세포 단층은 그림 2Aii의 최적화된 비정상 데이터에서 볼 수 있듯이 TEEI 반응을 감소시킵니다. 그러나 이 결과에 대한 이미지(그림 2Avi)는 여전히 Brooks et al.13이 제공한 TEEI 응답의 해석과 일치합니다. 기준선 아래로 내려가지 않았으며, 이는 세포 사멸이 거의 0에 가깝다는 것을 나타냅니다(그림 2C,D). 또한, 최소값에서 감소된 증가는 단층의 더 적은 셀이 총 PI 전달을 감소시키기 때문에 전달 효율성에 부정적인 영향을 미칩니다(그림 2C, D).
최적화되지 않은 파형이 적용되면 TEEI 응답이 훨씬 더 크게 감소할 수 있습니다. 총 에너지와 에너지가 적용되는 기간에 따라 최적화되지 않은 파형은 효율 감소에서 셀 단층의 거의 완전한 소멸에 이르는 결과를 생성할 수 있습니다(그림 2Ai,iii,v). 최적화되지 않은 곡선과 매우 최적화되지 않은 곡선 모두 기준선에서 상당한 감소를 보이며, 이는 상당한 세포 사멸을 나타냅니다. 그러나 점점 더 최적화되지 않는 파형은 세포 회수를 방해하여 전달 효율성을 감소시킵니다.
전달 효율은 전달 실험의 PI 및 calcein 이미지에 라벨링된 세포의 수를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 사멸은 TEEI 측정 실험에서 PI로 표시된 세포를 Hoechst로 식별된 총 세포 수로 나누어 계산했습니다. 셀 수는 두 지표 모두에 대해 사용자 지정 CellProfiler 파이프라인을 사용하여 결정되었습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> 그림 2: 일반적인 조건에 대한 TEEI 응답 곡선 및 이미징. (A) (i) 최적화 및 최적화되지 않은 조건에 대한 TEEI 변화율을 보여주는 TEEI 응답 데이터. (ii) 최적화된 파형 조건에서 정상 및 비정상 단층 간의 TEEI 응답 비교. (III-V) 세포 사멸(빨간색) 및 살아있는 세포(녹색)를 보여주는 최적화된 파형 및 최적화되지 않은 파형 조건에 대한 잠재적 결과의 대표 이미징. (vi) 세포 사멸(빨간색), 살아있는 세포(녹색)를 보여주는 최적화된 파형 조건을 적용한 후 건강하지 않은 단층의 대표적인 이미징. (B) 성공적인 PI 전달(빨간색), 살아있는 세포(녹색) 및 핵 위치(파란색)를 보여주는 이미지. 선명도를 위해 모든 이미지가 밝아졌습니다. 스케일 바: 1000 μm. (C) 주어진 전압에 대해 TEEI가 PSEP 이전 기준선에서 PSEP 후 최소 값으로 감소하고 PSEP 이후 최소 피크에서 PSEP 이후 피크로 증가합니다. (D) 주어진 전압에 대한 전달 효율 및 세포 사멸 비율. 오차 막대는 SEM(n = 6)을 나타냅니다. (C,D)는 Brooks et al.13의 허가를 받아 복제했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

porous-substrate-based-electroporation-with-transepithelial

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

유기 전기 트랜지스터는 생균과 통합 위장관 상피 장벽을 가로 질러 이온 플럭스를 모니터링하는 데 사용된다. 본 연구에서, 칼슘 킬레이트 EGTA (에틸렌 글리콜 - 비스 (베타 - 아미노 에틸 에테르)-N, N, N ', N'-테트라 아세트산의 존재에 의해 유도 타이트 접합 중단, 관련된 이온 플럭스의 증가, 산)가 측정된다.

유기 전기 트랜지스터와 장벽 조직 혼란의 감지

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

여기서, 우리는 경피 / 내피 전기 저항 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수와 저렴한 볼트 암페어 미터를 설정하는 방법을 보여줍니다.

프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 암페어미터를 사용하여 TEER 측정을 수행하는 간단한 접근 방식

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

체외에서 흥분성 세포의 반응을 연구하기 위해 이 프로토콜은 유전적으로 조작된 tet-on 스파이킹 HEK 세포의 간단한 흥분성 세포 모델에 대한 전기천공으로 인한 활동 전위 생성의 변화와 관련 매개변수의 자동 추출을 통한 막관통 전압의 변화에 대한 광학 모니터링을 설명합니다.

유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

이 프로토콜은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 분석을 위해 3차원 조직 모방 내에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 사용하여 계산 모델링을 사용하여 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 정량화합니다.

전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

배우세요 다공성 기판 전기천공법과 상피 전기 임피던스 측정을 결합한 고효율 세포 전달 기술. 이 방법은 세포 생존율을 유지하며 중간 단계 과정을 실시간으로 분석하여 최적의 펄스 파라미터를 식별합니다.

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

더 많은 동영상 탐색