Name: Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 쥐 장 조직의 Swiss roll 기법과 면역형광 염색을 활용한 장 상피세포 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 단일 파라핀 블록에서 장의 모든 영역을 시각화하여 연구 재료와 시간을 절약합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 ACE에 대한 K01 보조금 DK121869의 지원을 받았으며, 이 출판물은 T32 GM132055(RME), F31 DK139736(SAD), T32 DK124191(SAD), TL1 TR001451(RS), UL1 TR001450(RS) 및 SAD & RS에 대한 HCS 코너스톤 보조금의 지원을 받았습니다. 이 연구는 사우스캐롤라이나 의과대학(Medical University of South Carolina, MUSC)에서 ACE에 이르는 스타트업 자금의 지원을 받았으며, MUSC 소화기 질환 연구 핵심 센터(Digestive Disease Research Core Center, P30 DK123704)와 소화기 및 간 질환 분야의 COBRE(P20 GM120475)의 지원을 받았습니다. 이미징은 MUSC의 세포 및 분자 이미징 코어를 사용하여 수행되었습니다.

장 조직의 고품질 면역염색을 위한 효율적인 Swiss Roll Method

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
<li>Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieger%2C+J+%22Animal+models+of+allergic+disease%3A+Methods+and+protocols%22">Animal models of allergic disease: Methods and protocols</a>. , Springer US. New York, NY. (2021).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bswiss+roll%26%2334%3B%3A+A+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The &#34;swiss roll&#34;: A simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
<li>Lunnemann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecum+axis+%28cecax%29+preservation+reveals+physiological+and+pathological+gradients+in+mouse+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> J Vis Exp. (139), e58288(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+protocols%22">Histopathology: Methods and protocols</a>. , Springer New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Yang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+mechanism+of+mucosal+barrier+erosion+in+the+pathogenesis+of+acquired+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis.</a> iScience. 26 (10), 107883(2023).</li>
<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse tissue fixation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).</li>
<li>Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+preparation+techniques+for+histological+analysis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse.</a> Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat-induced+antigen+retrieval+following+inconsistent+formalin+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).</li>
<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

여기에서는 장 구조를 보존하고 정확한 면역염색을 촉진하기 위해 스위스 롤 기법을 사용하여 조직 고정에 최적화된 방법을 제시합니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 장 생리학 및 세포 생물학과 관련된 다양한 연구 질문을 조사하는 데 사용할 수 있다19. 몇 가지 최적화된 스위스 압연 방법이 발표되었으며 매우 유용합니다20,21. 이 기술의 장점은 여과지에서 장을 정확하게 쉽게 열 수 있다는 것입니다. 이를 통해 조직을 평평하게 고정할 수 있어 롤링할 때 조직이 안쪽으로 말리는 것을 방지할 수 있으며, 이는 근육이 두꺼워진 염증 조직을 분석할 때 특히 유용합니다. 또한 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 조직 절편의 중요한 역할을 강조하는 것이 중요합니다. 적절한 절편은 조직 구조의 보존을 보장하고 정확한 면역염색을 용이하게 하여 궁극적으로 다운스트림 분석의 성공에 기여합니다11. 최적화된 접근 방식은 다른 프로토콜에 비해 난이도가 낮아 개인마다 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 이 논문에서 제시된 기술은 또한 다양한 항체를 사용하여 잘 보존된 조직 구조, 다양성 및 재현성이 높은 면역염색을 제공합니다.
이 프로토콜의 중요한 측면은 고정 및 처리 시간입니다. 부적절한 조직 고정 및 처리는 조직화학적 분석을 손상시킬 수 있습니다. 과도하게 고정된 조직은 부서지기 쉬워지고 덜 고정된 조직은 너무 부드러워집니다. 과도하게 고정된 조직과 과소 고정된 조직 모두 절단하기 어렵고 면역염색을 손상시킵니다. 여과지에 해부한 후에는 사후 변형을 줄이기 위해 즉시 포르말린에 조직을 넣어야 한다22. 이 프로토콜에서 쥐 조직은 하룻밤 동안 포르말린으로 고정됩니다. 여러 연구에서 이 고정 시간20,23,24를 사용했습니다. 그러나, Boenisch et al.은 포르말린에 고정된 조직에서 최대 4일 동안 면역염색이 일관됨을 보여주었다25. 원하는 해석에 따라 고정 시간 및 정착제의 최적화가 필요합니다. 예를 들어, Carnoy's fixative는 종종 점액 염색에 선호됩니다26. 정착제의 선택과 정착 시간은 실험적 접근 방식에 따라 각 연구자가 최적화해야 합니다. 정확하고 일관된 처리 시간을 보장하기 위해 자동 조직 처리기를 사용하는 것이 좋습니다. 우리 실험실은 장 조직을 롤처럼 제자리에 고정하기 위해 작은 핀을 사용합니다. 핀이 없으면 가공 중에 티슈가 풀릴 수 있습니다. 이 핀은 매우 작고 날카롭기 때문에 예방 조치를 취해야 합니다. 조직 가공 전에 와이어 커터를 사용하여 핀의 날카로운 끝을 제거하는 것이 좋습니다. 일부 조직학 코어는 핀이 있는 조직을 허용하지 않습니다. 따라서 사용하기 전에 확인하는 것이 가장 좋습니다. 또 다른 접근법은27을 처리하기 전에 한천을 사용하여 조직을 고정하는 것이며, 카세트 스폰지를 카세트에 사용하여 롤을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
면역염색은 각 항체에 대한 최적화가 필요한 프로토콜입니다. 가능하면 knockout-validated 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 조직 고정 및 처리를 위한 이 방법은 명확한 염색을 생성하여 검증되지 않은 항체를 사용할 때 배경 신호와 비교하여 항체 결합을 쉽게 식별할 수 있습니다. 정착제 선택, 항원 회수 및 항체 희석은 항체의 특이성에 영향을 미칠 수 있습니다. 연구자들은 각 항체에 대한 고정, 항원 회수 및 배양 시간을 조정하여 프로토콜을 신중하게 평가하고 최적화할 것을 권장합니다. 최상의 결과를 얻기 위해, 최적의 농도를 결정하기 위해 다양한 희석액에서 항체를 테스트하고 다양한 항원 회수 완충액에서 항체를 테스트해야 합니다. Epitope retrieval은 고정 중에 형성된 methylene bridge를 파괴하여 면역염색을 개선합니다. 이 프로토콜에서는 단백질 분해 유도 에피토프 회수 대신 열 유도 에피토프 회수가 사용되는데, 이는 효소 분해가 조직 형태를 방해할 가능성이 더 높기 때문이다28. 가장 흔한 열 유도 에피토프 회수 완충액은 구연산염 완충액, tris-HCl 및 tris-EDTA이며, 구연산염 완충액은 조직 형태에 가장 부드럽습니다29. 완충액 선택은 다양하며 각 항체에 대해 결정해야 합니다. 많은 항원 회수 완충액, 차단 용액 및 항체 희석제가 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 이러한 솔루션은 매우 비싸고 비용이 많이 들 수 있습니다. 비용 효율성을 보장하기 위해 일반적인 항원 회수 용액과 차단 및 항체 희석제 용액의 레시피를 제공했습니다. 
이 방법의 한계는 고정 및 처리가 조직을 변화시키고 에피토프를 가릴 수 있다는 것입니다. 또 다른 방법은 신선 냉동 조직을 면역염색하는 것입니다. 신선 냉동 조직은 스냅 냉동되어 독성 고정제에 대한 노출을 피하고 단백질 구조를 보존하며 일부 에피토프의 접근성을 향상시킵니다. 그러나 조직 구조와 형태는 고정 및 파라핀 포매 조직보다 열악합니다. 신선 냉동 조직의 또 다른 과제에는 냉동 블록과 슬라이드를 절단하고 보관하는 데 필요한 재료와 물류가 포함됩니다. 스위스 롤과 장 조직 스트립의 분석은 이전 보고서에서 설명한 바와 같이 융모의 높이와 너비의 차이와 lamina propria의 면역 세포의 차이를 보여줍니다30. 이러한 결과는 장내 스위스 롤이 일부 장 기능을 변화시킨다는 것을 시사하며, 이는 실험을 계획할 때 고려해야 합니다. 또한, 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에 특이적으로 결합하는 많은 항체가 신선 냉동 조직에서 잘 염색되지 않기 때문에 항체 재검증이 필요하다31.
장 조직의 면역염색은 위장 세포 생물학 및 생리학에 관한 다양한 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기법은 장 염증 환경, 세균 감염 후 및 암 진행 중 상피 변화를 식별하는 데 널리 사용됩니다. 여기에 제시된 방법은 비용 효율적이고 기술적으로 까다롭지 않으며 재현성이 높기 때문에 장 조직 보존에 이상적입니다. 최상의 결과를 보장하기 위해 실험 설계와 테스트 중인 가설을 기반으로 이 프로토콜에 설명된 단계를 최적화하는 것이 좋습니다.

장의 세포 구조는 면역염색을 위해 장 조직을 보존할 때 구조적 무결성을 유지하는 데 고유한 문제를 제기합니다. 소장은 융모1로 알려진 길쭉한 손가락 모양의 구조로 구성되어 있습니다. 이러한 융모는 종종 임베딩 과정에서 기형이 됩니다. 연구자가 장을 적절하게 삽입하여 단면을 얻을 수 있는 기술을 갖추도록 하고, 장의 모든 영역과 장을 구성하는 층(즉, 근근, 점막 및 장막)을 시각화할 수 있도록 하는 것은 강력한 실험 분석에 매우 중요합니다2. 부적절한 고정, 과도한 고정 및 부적절한 조직 취급은 조직 무결성을 손상시켜 장 상피에 부주의한 손상을 초래합니다 3,4. 이러한 단계에서 장 상피를 손상시키면 면역조직화학 프로토콜 및 사용된 항체의 효능에 관계없이 면역형광과 같은 후속 분석의 품질이 크게 저하될 수 있습니다.
적절한 조직 고정과 같은 면역염색은 생물의학 연구의 중요한 부분입니다. 면역염색이 잘 이루어지면 이전에 알려지지 않은 세포 구조 및 기능의 측면을 밝힐 수 있습니다. 파라핀 절편의 면역형광 염색은 고정 및 파라핀 포매 과정으로 인한 물리화학적 변형으로 인해 까다로울 수 있다5. 고정 및 파라핀 임베딩은 관심 항원결정기(epitope)의 면역형광 검출을 방해할 수 있는 항원 마스킹을 초래한다6. 지연된 고정은 단백질 분해를 유발할 수 있으며, 이로 인해 중요한 에피토프(epitopes)의 염색이 약화되거나 아예 나타나지 않을 수 있다7. 또한 항체는 배경 수준이 높으면 부정확한 경우가 많습니다. 일관되고 특이적인 항체 결합과 높은 신호 대 잡음비를 촉진하는 면역염색 프로토콜은 연구자에게 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 
여기에서는 장 조직 고정, Swiss roll preparation8 및 immunostaining을 통해 고품질 면역형광 이미지를 얻도록 설계된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 장의 무결성을 보존하기 위한 지침을 강조하는 이 프로토콜은 면역형광 이미징 연구의 품질과 신뢰성을 향상시키기 위한 강력한 방법론을 연구자에게 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 또한 여과지 및 수제 항원 검색, 차단 용액 및 항체 희석제를 포함한 비용 효율적인 리소스를 사용하여 자금이 제한될 수 있는 실험실에서 프로토콜에 더 쉽게 접근할 수 있도록 노력했습니다. 모든 실험 프로토콜과 마찬가지로 연구자는 실험 접근 방식과 관심 영역에 따라 현재 프로토콜을 최적화해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>셀룰로오스 여과지</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Thick Whatman 종이</td></tr><tr><td>하전 유리 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>해부 핀 크기 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 장갑</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>슬라이드 워머</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>전자 현미경 과학</td><td>64111-04</td><td>클리어링 시약</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>대형 카세트</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-on-mouse blocking 시약</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>마우스 온 마우스 블록</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>압력솥</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong gold antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>역방향 액션 집게</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 랙</td><td>Tissue-tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 염색 세트</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>내용제성 접시 및 금속 프레임</td></tr><tr><td>소형 카세트</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 이수화물</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>차단 완충액</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>와이프</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 화학</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

intestinal swiss rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

장은 소장과 대장으로 구성된 복잡한 장기입니다. 소장은 십이지장(duodenum), 제주눔(jejunum), 회장(ileum)으로 더 나눌 수 있습니다. 장의 각 해부학적 영역은 세포 구조의 차이에 의해 반영되는 고유한 기능을 가지고 있습니다. 장의 변화를 조사하려면 다양한 조직 영역과 세포 변화에 대한 심층적인 분석이 필요합니다. 장을 연구하고 큰 조직 조각을 시각화하기 위해 연구자들은 일반적으로 장 스위스 롤로 알려진 기술을 사용합니다. 이 기술에서는 장을 각 해부학적 영역으로 나누어 평평한 방향으로 고정합니다. 그런 다음 조직을 조심스럽게 굴려 파라핀 포매를 위해 가공합니다. 적절한 조직 고정 및 배향은 종종 간과되는 실험실 기법이지만 다운스트림 분석에서는 매우 중요합니다. 또한 장 조직을 부적절하게 롤링하면 연약한 장 상피가 손상되어 면역염색을 위한 조직 품질이 저하될 수 있습니다. 온전한 세포 구조를 가진 잘 고정되고 적절하게 방향이 지정된 조직을 보장하는 것은 장 세포의 최적 시각화를 보장하는 중요한 단계입니다. 우리는 단일 파라핀 내장 블록에 장의 모든 부분을 포함하도록 스위스 롤을 만드는 비용 효율적이고 간단한 방법을 제시합니다. 또한 장 상피의 다양한 측면을 연구하기 위해 장 조직의 최적화된 면역형광 염색에 대해 설명합니다. 다음 프로토콜은 장 조직 고정, 스위스 롤 기법 및 면역염색을 통해 고품질 면역형광 이미지를 얻기 위한 포괄적인 가이드를 연구자에게 제공합니다. 이러한 정교한 접근법을 사용하면 장 상피의 복잡한 형태를 보존하고 장 생리학 및 병리생물학에 대한 더 깊은 이해를 촉진할 수 있습니다.

헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 염색을 앞서 설명한 바와 같이 수행하였다12. 최적화된 방법을 사용하여 장 스위스 롤은 소장과 대장의 세 부분을 모두 단일 슬라이드에 포함했습니다. 전체 장을 슬라이드에 수용하면 연구원은 장의 모든 부분의 변화를 분석할 수 있으며 시약을 절편하고 염색하는 데 드는 비용을 절약할 수 있습니다(그림 1). 또한 면역염색 시 모든 장 분절을 동일한 용액에 동시에 노출시키면 정확한 결과를 보장하는 데 도움이 됩니다. H&amp;E 현미경 사진은 소장과 대장의 모든 부분의 보존된 장 구조를 보여줍니다(그림 2). 십이지장 융모를 측정한 결과, 이 스위스 롤 방법에 비해 미개봉 장 조직의 융모 높이에 큰 차이가 없었으며, 이는 장을 열어도 조직 구조를 방해하지 않는다는 것을 시사합니다(그림 2D). 장 스위스 롤의 면역염색은 장의 다양한 층과 전체 융모 크립트 축을 보여줍니다. 형광 이미지는 1차 및 2차 항체 염색에서 낮은 배경 수준을 보여주며 상피에 존재하는 개별 세포를 명확하게 묘사합니다. 그림 3 은 잔 세포(MUC2 양성 세포)13, 정점막(γ-ACTIN)14, 상피 세포(E-CADHERIN)15의 외측막15 및 핵에 대한 다양한 장 분절 및 염색의 형태를 보여줍니다. 이 프로토콜은 증식 세포(proliferative cells, PCNA)16, 간질(interstitium, LAMININ; 그림 4A) 17, 리소좀 도메인(LAMP1)14 및 상피(β-CATENIN; 그림 4B) 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> 그림 1: 장내 스위스 롤의 준비 및 가공을 위한 워크플로우. (A) 장 분절은 PBS가 함유된 주사기로 세척한 다음 PBS에서 세척합니다. (B) 그런 다음 젖은 장 조직을 건조한 여과지에 놓습니다. (C) 장을 여과지에서 세로로 자르고 (D) 부드럽게 펼칩니다. (E) 열린 장 위에 여과지 조각을 놓고 장을 여과지 사이에 부드럽게 끼우고 스테이플러로 고정합니다. 장 분절은 하룻밤 동안 고정하고 (F)는 집게를 사용하여 굴립니다. (G) 장은 역작용 겸자에서 부드럽게 제거되고 (H)는 장미 모양입니다. (나, J) 장 조직을 핀으로 고정하여 큰 카세트에 넣습니다. (K) 4개의 장 분절은 모두 조직 처리 및 매립을 위해 동일한 카세트에 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> 그림 2: 장의 4개 분절 모두의 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신 염색. (A) 타일 스캐닝은 십이지장, 제주눔, 회장 및 결장의 개별 스위스 롤을 사용하여 단일 슬라이드에서 전체 장을 시각화할 수 있는 능력을 보여줍니다. (B) 장내 스위스 롤의 현미경 사진 및 (C) 융모 및 크립트 구조를 보여주기 위한 더 높은 배율 삽입물. (D) 소장 융모 길이의 정량화는 스위스 압연 조직과 미개봉 조직 간에 유의한 차이가 없음을 보여줍니다. 스케일 바 = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> 그림 3: 장의 4개 분절 모두의 면역형광 염색. 성체 C57BL/6J 대조군 마우스는 핵(청록색), 외측막 마커인 E-CADHERIN(녹색), MUC2(노란색)로 식별되는 잔 세포 및 정점 브러시 테두리 마커인 γ-ACTIN(자홍색)에 대해 면역염색되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> 그림 4. 장의 면역 형광 염색. (A) 생쥐 장의 면역형광 염색을 보여주는 대표적인 현미경 사진은 핵(청록색), 증식 세포, PCNA(녹색) 및 lamina propria, LAMININ(자홍색)을 강조합니다. (B) 장에서 핵(청록색), 세포막 마커 β-CATENIN(녹색) 및 리소좀 마커 LAMP1(자홍색)을 식별하는 면역형광 이미지. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

장은 소화와 흡수에 매우 중요합니다. 십이지장, 제주눔, 회장, 결장 등 각 부위는 독특한 세포 구조로 인해 뚜렷한 기능을 수행합니다. 장 생리학을 연구하려면 세심한 조직 분석이 필요합니다. 이 프로토콜은 스위스 롤 기법을 사용한 조직 고정 및 처리를 간략하게 설명하며, 적절한 조직 보존 및 배향을 통해 정확한 면역염색을 보장합니다.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

optimized-protocol-for-intestinal-swiss-rolls-immunofluorescent

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 자유 부유 마우스 jejunum 동결절편에서 장 다발 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법을 보여줍니다. 장 융모 내에서, 확장된 붉은 뿌리 덩어리와 함께 내강 끝에서 녹색 형광의 공동 국소화는 다발 세포의 존재를 나타냅니다.

Jejunum cryosections에서 Tuft 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

이 프로토콜은 원래 쥐 장을 위해 개발된 '스위스 롤' 기법을 수정한 전체 위 면역염색법을 개략적으로 설명합니다.

수정된 스위스 롤 기법을 이용한 생쥐 위근층의 향상된 공간 지도 작성

배우세요 쥐 장 조직의 Swiss roll 기법과 면역형광 염색을 활용한 장 상피세포 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 단일 파라핀 블록에서 장의 모든 영역을 시각화하여 연구 재료와 시간을 절약합니다.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

더 많은 동영상 탐색