Name: Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 테트라사이클린 유도 합성 회로를 이용한 Leishmania major 감염의 면역대사 조절 방법. 이 기술은 숙주 단백질과 기생충 상호작용을 연구하여 리슈만편모충증 치료 전략을 개선합니다.

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저자들은 우리의 연구와 BRIC-NCCS 생물정보학 시설을 지원해 준 푸네의 국립 세포 과학 센터(BRIC-NCCS)의 생명공학 연구 및 혁신 위원회 소장에게 감사의 뜻을 전합니다.

리슈마니아증 치료를 위한 테트라사이클린 제어 합성 회로 설계

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저자는 밝힐 것이 없습니다.

얻어진 결과는 합성 회로의 설계 및 구현을 위해 채널화 된 파이프 라인의 효율성을 강조합니다. 이 합성 회로의 건설은 리슈만편모충증과 같은 전염병에 대한 정밀 의학을 개발하기 위한 단계였습니다. 유전자 부분의 인실리코(in silico ) 조립과 결정론적 시뮬레이션을 통해 TetON 시스템의 뚜렷한 조절 효과를 모니터링했습니다. 특히 회로의 효과는 TetR과 SDHA/GFP의 상호 쌍안정 발현으로 이어질 수 있습니다. SDHA의 발현은 주기적이었으며, 이는 독시사이클린의 존재 하에서만 그 발현이 증가했음을 나타낼 수 있습니다. 일정 기간 동안 표현 패턴의 잠재적인 변화를 관찰하기 위해 시간 단위 100을 선택했습니다. 그 결과, 합성 회로는 TetR 및 SDHA/GFP에 대해 주기적인 거동을 보였는데, 이는 그의 직교 특성에 기인하는 것으로 보인다21. iGEM 부품 레지스트리에서 유전자 부분의 조립은 합성 회로22를 구성하는 데 필요한 유전 구성 요소를 제공했기 때문에 중추적인 역할을 했습니다. 유전자 부분의 모듈식 배열은 회로의 번역 및 기능이 영향을 받을 수 있으므로 필수적이며, 이는세포(23)에서 비효율적인 발현 및 조절 효과로 이어질 수 있습니다.
합성 회로의 인서트 크기는 벡터의 크기가 너무 크지 않도록 약 1.3kb였으며, 이는 잠재적으로 변환 효율(24)을 감소시킬 수 있습니다. 적절한 벡터를 선택하는 것은 박테리아 시스템에서 복제 수를 늘리고 높은 플라스미드 복사본을 생성하는 데 필수적인 유전 부분을 소유해야 하기 때문에 중요한 단계이며, 그 발현 기계는 포유류 시스템25에서 잘 적응해야 합니다. pEGFP-N1 벡터는 RAW264.7 세포주에서 잘 특성화되어 있으며 다중 클로닝 사이트(multiple cloning site)26을 가진 조밀한 플라스미드 구조를 가지고 있습니다. 고농축 및 순수 플라스미드의 생산을 보장하기 위해 플라스미드 분리에 실험실 표준 버퍼 용액을 사용했으며, 이는 분광 광도계 추정 및 AGE를 통해 검증되었습니다. pEGFP-N1 벡터에 합성 회로를 삽입하는 것은 제한 분해를 통해 검증하고, 샘플은 AGE 및 시퀀싱에서 분석했습니다. AGE 결과는 1.3kb 대역의 인서트, 4.7kb 대역의 pEGFP-N1 벡터 및 전체 합성 회로의 6kb 대역을 나타냈습니다. 
DNA: PEI 비율의 1:1, 1:2 및 2:1 비율을 사용한 형질주입이 수행되었으며, 관찰된 1:1 비율이 세포 형태를 방해하지 않고 가장 잘 작동했습니다(데이터 표시 안 됨). 형질주입된 세포의 선택을 위해 400 μg/mL - 1000 μg/mL 농도의 G418을 사용하는 것이 권장된다27. 500μg/mL의 G418은 형질주입된 세포의 세포 성장 또는 형태를 손상시키지 않으면서 비형질주입된 세포의 성장을 효과적으로 억제했기 때문에 형질주입된 세포의 선별에 사용되었습니다(데이터는 표시되지 않음). transfection 효율성에서 세포 표현형의 중요성을 감안할 때, 특히 분화를 거칠 수 있고 transfection이 까다로워질 수 있는 대식세포 세포주에서 RAW264.7 세포주의 낮은 통로 수를 형질전환에 사용했습니다28. 세포 통로 수도 transfection 효율성에 중요한 요인이 될 수 있습니다. 높은 통로 수는 비효율적인 transfection(transfection)을 유발할 수있다 29. Dox는 TetR에 대한 높은 결합 효율, 유리한 조직 분포, 낮은 독성 및 24시간30의 반감기 때문에 Tet-ON 유도 시스템에 선호되는 유도제입니다. transfection 후, 세포는 24시간 동안 dox로 유도되었고, GFP 발현을 위해 관찰되었습니다. RAW264.7 세포의 경우 합성 회로 유도에 사용된 dox의 농도는 1μg/mL였으며 이는 1-2μg/mL31 의 권장 범위에 속합니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 유도 후 SDHA 농도의 조절은 결정되지 않았습니다. 전반적으로, 세포 통로 수, DNA: PEI 농도, 포유류 transfection selection marker 농도 및 doxycycline induction concentration의 측정 및 표준화는 transfection 과정에서 중요한 요소입니다.
다른 시점에서 감염 후 합성 회로를 유도한 후, 세포 내 기생충 부담이 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다. 감염된 샘플과 IMTI 샘플 간의 기생충 부하를 비교한 결과, 합성 회로로 유도된 세포의 부담이 더 낮았으며, 이는 SDHA 발현에 기인하는 것으로 보입니다. SDHA 발현이 NO 생성과 연관되어 있기 때문에, IMTI 세포는 NO가 생성될 때 RAW264.7 세포주에서 발생하는 불규칙하고 거친 형태학적 형태를 갖는 것으로 관찰되었다32. 감염 후 6시간 후 IL-10 및 IL-12 수치가 가장 높았는데, 이는 두 사이토카인 모두 이 시점에서 상향 조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 IL-12보다 IL-10을 더 많이 생성하기 위해 표현형 변형을 추가로 거치기 때문이다19. IL-10 및 IL-12 수준은 transfection 후 IMTI 샘플에서 유의한 변화를 일으키지 않았기 때문에 전염증성 및 항염증성 사이토카인 반응을 검출하기 위해 사이토카인 프로파일링을 수행했습니다. 
TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β의 발현 수준은 6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에서 확인되었습니다. 세포 내 기생충을 제거하기 위해 TNF-α 및 IFN-γ은 NO 생성을 통해 산화 폭발을 유도하기 때문에 주로 필수적입니다. M2 편광 대식세포는 TGF-β를 발현하며, 이는 전염증성 사이토카인을 하향 조절한다33. 24시간 IMTI 샘플은 TGF-β보다 TNF-α 및 IFN-γ 발현이 증가했으며, 이는 대식세포가 L. major에 대한 transfection 및 감염 시 전염증성 사이토카인을 발현하는 표현형으로 분극되었을 수 있음을 시사합니다. 따라서 이 연구는 합성 회로를 사용한 transfection 시 유도된 표현형 변화에 대한 통찰력을 제공하고 감염 역학을 강조합니다. 합성회로가 치료제로서 미치는 영향은 항염증성 사이토카인에 비해 전염증성 사이토카인 발현을 유의미하게 증가시켰기 때문에 조사할 수 있습니다. 따라서 이 연구는 합성 회로 구성 및 전달 파이프라인을 확립했을 뿐만 아니라 리슈마니아증 도전 숙주 세포에서 전염증성 사이토카인의 상향 조절을 통해 리슈마니아증 모델에서 치료 잠재력을 입증했습니다.

전체론적 통합 의학의 발전은 면역 세포의 대사 변화와 감염성 질환에서 면역 세포 표현형을 조절하는 능력 사이에 확인된 중요한 연결 고리입니다. 면역 대사는 인간에게 널리 퍼진 전염병의 발병 기전을 밝히기 위한 새로운 관점을 제공합니다. 또한, 중재를 위한 새로운 표적을 식별함으로써 백신 및 약물 개발을 위한 유망한 기술을 제공합니다1. 면역 세포의 대사 재프로그래밍은 리슈마니아증을 포함한 다양한 감염성 질환에서 확인됩니다. 리슈마니아 종 리슈마니아증을 일으키는 원인이 되며, 그 중 리슈마니아 메이저 (L. major)는 피부 리슈마니아증(CL)을 유발합니다. L. 주요 기생충은 세포 내 기생충으로서 증식과 생존을 위해 숙주 세포, 특히 대식세포의 대사에 상당한 영향을 미친다2. 대식세포는 일반적으로 M1 세포가 높은 전염증성 사이토카인 분비 및 질소 종의 대사를 통해 산화질소(NO) 생성을 갖는 고전적 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화된(M2) 부분집합으로 분극될 수 있습니다. M2 세포는 항염증성 사이토카인 수치가 높아지고 질소 대사를 통해 높은 아르기나아제 활성을 나타낸다3. 따라서 두 표현형 모두 면역 반응뿐만 아니라 대사 경로에서도 다릅니다.
리슈마니아증의 시스템 생물학은 약물 설계 및 개발을 통해 새로운 치료법을 설계하기 위한 분자 표적을 식별하는 것을 목표로 합니다. 신호 전달 네트워크 및 대사 경로의 재구성은 리슈만편모충증을 전체론적 모델로 이해하는 데 도움이 되며 질병 상태를 주도하는 주요 구성 요소를 식별하기 위한 통찰력을 도출합니다. 수학적 모델링은 리슈만편모충증4의 복잡성을 이해하기 위해 가장 선호되는 응용 분석 접근법 중 하나입니다. 면역대사 네트워크 및 수학적 모델을 통해 기생충을 제거하기 위해 발현되는 M1 표현형의 핵심 구성 요소인 석시네이트 탈수소효소(SDHA)를 식별할 수 있었다5. 합성생물학은 리슈만편모충증의 진단, 백신 개발 및 치료제에 응용되고 있습니다. 면역 반응 조절을 목표로 하는 신진대사는 합성생물학 도구를 통해 달성할 수 있습니다. 스핑고지질 대사를 조절하고 숙주 면역 신호 전달을 변경하는 이노시톨 포스포릴 세라마이드 합성효소의 조절을 위해 쌍안정 행동을 가진 유전 회로를 사용하여 L. 주요 감염 모델 6,7의 내재적 견고성을 종합적으로 조정했습니다. 따라서 시스템 및 합성생물학은 리슈마니아 모델 시스템에서 정밀 의학 개발을 위한 모델 기반 유전 공학 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
M1 표현형은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)과 대사 경로(metabolic pathway)의 생성이 시너지 효과를 발휘하여 기생충 제거를 향상시키는 면역 대사 신호 네트워크의 발현으로 표시됩니다. M1 분극은 인터루킨-12(IL-12), 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 의미합니다. M1 표현형에서 고도로 농축된 대사 경로에는 해당과정(glycolysis), 펜토스 인산염 경로(pentose phosphate pathway) 및 truncated tricarboxylic acid cycle(TCA cycle)이 포함됩니다5. 잘린 TCA 사이클은 증가된 숙시네이트 및 시트레이트 수치를 통해 기생충 제거 기계를 지시하며, 이는 NO3의 생산을 안내합니다. SDHA에 의한 숙시네이트의 축적은 전사 인자 저산소증 유발 인자 1-알파(HIF-1α)의 활성화를 유도하여 IL-1β8의 생성을 유도합니다. M2 표현형에서는 인터루킨-10(IL-10), 형질전환성장인자베타(TGF-β), 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)3과 같은 항염증성 사이토카인의 생성과 함께 지방산 산화, 글루타민 이용 증가 및 포도당의 산화적 인산화 향상이 관찰됩니다. M2는 길쭉한 미토콘드리아를 특징적으로 나타내어 에너지 생성 효율성을 향상시킵니다. 그들은 지방산, 포도당 및 글루타민을 기질로 사용하여 TCA 회로에 연료를 공급함으로써 더 빠른 속도로 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성하여 기생충 성장과 증식을 촉진합니다9. truncated TCA를 통한 숙시네이트 축적을 담당하는 SDHA 효소는 NO 생성을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 전자 수송을 통해 석시네이트 의존성 산소 소비를 시작할 수 있다10. 리슈마니아에 감염된 대식세포에서 SDHA는 2.17배 하향 조절되며, 이는 호기성 호흡도 하향 조절될 수 있음을 시사한다11. 석시네이트 섭취를 늘려 전염증성 사이토카인 매개 NO 생성을 유도하고 기생충 제거를 촉진하기 위해서는 SDHA의 발현이 필수적입니다.
합성 회로는 시공간 수준에서 건강한 표현형을 복원할 수 있는 쌍안정 진동을 달성하기 위해 질병 시스템을 변경할 수 있는 정밀 표적 요법을 제공합니다. 합성 회로 전달 및 표현은 시스템을 역동적이고 견고하게 만듭니다. 합성생물학의 발전에 기여하는 한 가지 중추적인 요인은 유전적 부분과 요소를 모듈식으로 조립하여 복잡한 아키텍처와 맞춤형 기능을 생성할 수 있는 능력에 있습니다12. 전통적인 발현 기법과 관련된 제약으로 인해 테트라사이클린 오페론 기반 유도 플라스미드 합성 회로의 출현이 촉진되었으며, 이에 따라 플라스미드를 신속하게 평가하고 다양한 세포 유형에 걸쳐 쉽게 전달할 수 있게 되었습니다13. 테트라사이클린 반응성 억제자(TetR) 단백질은 이량체로 존재할 때 테트 오페론(TetO)에 강한 결합 친화력을 나타내어 전사를 효과적으로 억제합니다. 그러나 리간드인 독시사이클린(dox)의 상호 작용에 따라 TetR은 구조적 변화를 겪어 TetO에서 분리되어 결과적으로 전사가 방해받지 않고 진행될 수 있습니다. 이 회로는 단백질 번역 제어14를 나타낼 수 있다. 따라서, 정의된 방법론을 통해, 설계된 테트라사이클린 오페론 기반 유도 플라스미드 합성회로를 통해 pEGFP-N1 벡터에서 SDHA를 발현할 수 있게 되었습니다. 회로의 변환 효율성과 수율에 대한 평가는 납품 능력에 대한 통찰력을 제공했습니다. 벡터의 제한 분해를 통해, 클로닝 효율의 측정이 확인되었습니다. 또한, Balb/c 마우스의 복막 대식세포에서 유래한 형질주입된 RAW264.7 마우스 대식세포 세포주가 형질주입된 세포에서 독시사이클린 용량 의존성 녹색 형광 단백질(GFP) 발현에 대해 관찰되었습니다. 또한, 형질주입된 세포에서의 기생충 제거 효과는 합성 회로의 발현으로 확증되었습니다. 또한, 전염증성 사이토카인의 유도 및 발현이 관찰되었는데, 이는 합성 회로의 기능과 직접적인 관련이 있는 합성 회로 transfected 및 유도 세포의 감염 시점 증가를 통해 지시되었습니다.

<table><tbody><tr><td>10 &뮤; L 팁</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X 제한 버퍼</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>제한 소화</td></tr><tr><td>1mL 팁</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 팁</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 플라스크</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>50mL 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt 시안/오렌지 로딩 버퍼</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>AGE</td></tr><tr><td>96 웰 커버슬립 바닥 플레이트</td>용 샘플 <td>로딩 ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>컨포칼 이미징 및 트랜스펙션용</td></tr><tr><td>96 웰 마이크로 테스트 플레이트, 평평한 바닥 웰</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agarose Sigma</td><td>A9539</td><td>AGE</td></tr><tr><td>용 Agarose 젤 전기 영동 어셈블리</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>용 AGE</td></tr><tr><td>세균</td>류 <td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>For transformation</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>완충액 / 시약 준비</td></tr><tr><td>세포 배양 층</td>류 <td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>용 세포 스크레이퍼</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>용 세포 스프레더</td><td>Fischer Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 튜브용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘용 원심분리기</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>RNA 분리용</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>플라스미드 농도 추정</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 gel imager</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>For AGE</td></tr><tr><td>DEPC TREATED H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>For RNA isolation</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Merck</td><td>33429</td> For <td>induction of transfected cells</td></tr><tr><td>건식 가열 블록</td><td>Labnet</td><td></td><td>제한 효소의 형질전환 및 불활성화를 위해</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>National centre for cell science 세포 배</td><td></td><td>양을 위해</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>완충액/시약 준비</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>AGE</td></tr><tr><td>용 Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Fischer</td><td>Scientific 12635</td><td>Buffer / 시약 제제</td></tr><tr><td>Evos 명시야 현미경</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>합성 회로 Fetal</td></tr><tr><td>Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>FV31S-SW 소프트웨어</td><td>Olypmus</td><td></td><td>이미지 획득</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td></td><td>transfection을 위한</td></tr><tr><td>1563411 복제를 위한 Gibson 조립 방법</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>합성 회로의 구성</td></tr><tr><td>Graphpad 프리즘</td><td>Graphpad</td><td></td><td>통계 분석</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>cDNA 합성을 위한</td><td>4368814</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>완충액 / 시약 준비</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>형질 전환 및 식민지 선택</td></tr><tr><td>용 Luria Bertini 국물</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td> coli</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>버퍼 / 시약 준비</td></tr><tr><td>Micro Filt 수직 층류 기류</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8-튜브 스트립, 0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 8-캡 스트립</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>전자레인지 LG</td><td></td><td>MC-7649DW</td><td>For AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman 프로브</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman 프로브</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman 프로브</td></tr><tr><td>마우스 ELISA 키트 IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>마우스 ELISA 키트 IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky용 터치 스크린 + &mu; 드롭 플레이트</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>MX-M 마이크로플레이트 믹서용 96웰 세포 배양 플레이트 믹서 조정 가능한 0-1500rpm 실험실용 셰이커 교반기</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>국립 생명공학 정보 센터</td><td>합성</td><td>회로 건설을 위한</td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov <td></td></tr><tr><td>Neubauer's chamber</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>세포 수</td></tr><tr><td>비환기식 25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>353014</td> 기<td>생충 배양용</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유수</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>시약 준비</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 소프트웨어</td><td>올림푸스</td><td></td><td>이미지 프로세싱</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>컨포칼 이미징용</td></tr><tr><td>OPTI-MEM 매체</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>매체 합성</td></tr><tr><td>회로로 복제된 트랜스펙션 pEGFP-N1 벡터</td>용 <td>배지 Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>ThermoFischer, Scientific</td><td>15070063</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>트랜스펙션용</td></tr><tr><td>칼륨 아세테이트</td><td>피셔 과학</td><td>YBP364500</td><td>완충액 / 시약 준비</td></tr> 염화<tr><td>칼</td>륨 <td>피셔 과학적</td><td>BP366</td><td>버퍼 / 시약 준비</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>P5655</td><td>버퍼 / 시약 준비</td></tr><tr><td>전원 공급 장치 팩</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>For AGE</td></tr> 표준 <tr><td>생물학적 부품</td><td>등록 https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>합성 회로의 건설을 위해</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>RNA 분리를 위해</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>완충액 / 시약 준비</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 매체</td><td>세포 과학</td><td></td>을위한 국립 센터 <td>기생충</td></tr><tr><td>배양 Shaker incubator</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>배양용 E.coli</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td></td><td>Q27605</td> 완충액/<td>시약 준비</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>완충액/시약 준비</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>버퍼/시약 준비</td></tr> 인<tr><td>산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S5136</td><td>버퍼/시약 </td></tr><tr><td>준비 분광 광도계</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>플라스미드 농도 추정</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Real Time PCR 시스템</td><td>생명 기술</td><td>272006777</td><td>qRT-PCR용</td></tr><tr><td>StepOne 소프트웨어 버전 2.3</td><td>qRT-PCR용</td><td>Life 기술</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), AmpErase UNG 없음</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker cell</td><td></td><td></td><td>합성 회로 구성 및 시뮬레이션</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>For AGE</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Buffer /Reagent preparation</td></tr><tr><td>Tris-acetate-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>완충액 /시약 준비</td></tr><tr><td>Trypan 파란</td><td>시그마</td><td>T8154</td><td>세포 수를</td></tr> 위해 <tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>제한 효소</td></tr></tbody></table>

immunometabolic circuits in infection for advancing host directed therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

면역 대사는 리슈만편모충증의 진행에서 중추적인 결정 요인입니다. 합성생물학 기반 접근법은 리슈만편모충증을 유발하는 숙주 관련 요인을 표적으로 하는 치료적 개입을 향한 단계로 상당한 주목을 받고 있습니다. 합성생물학은 생물학적 시스템을 정밀하게 조절하고 세포에 새로운 기능을 부여하기 위해 직교하고 모듈화된 방식으로 유전 구성 요소를 엔지니어링하는 것을 수반합니다. 제시된 연구에서는 유도성 테트라사이클린 제어(TetON) 기반 합성 회로 개발을 위한 체계적인 파이프라인을 규명하는 것을 목표로 했으며, 세포 내 리슈마니아 기생충 제거를 촉진하기 위한 치료제로 석시네이트 탈수소효소를 전달하는 것을 목표로 했습니다. 개요된 프로토콜은 합성 회로의 설계와 후속 검증을 설명합니다. 제안된 전략은 또한 플라스미드 백본(plasmid backbone)에 합성 회로를 전달 수단(delivery vehicle)으로 통합하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 합성 회로의 전달을 위해 폴리플렉스 기반 나노 입자를 사용하는 전달 기계는 세포 형태를 손상시키지 않고 쥐 대식세포 세포주에 사용되었습니다. 형질주입된 세포를 선택하고 합성 회로 발현을 위한 최적의 유도 농도를 결정하기 위해 방법의 표준화를 수행했습니다. 관찰 결과, 감염된 세포에 비해 transfection된 세포의 세포 내 기생충 부담이 뚜렷하게 감소한 것으로 나타났습니다. 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)은 기생충 제거를 촉진하기 위한 기전으로 합성 회로 transfection되고 유도된 세포에서 감염 후 발현되었습니다. 이는 합성생물학 기반 방법이 질병 진행과 관련된 숙주 요인을 표적으로 삼아 리슈마니아증에 대한 강력한 접근 방식임을 강조합니다.

합성회로를 발현하기 위한 합성회로를 형성하는 유전자 부분의 배열은 (도 1A)에 나타내었다. 해당 부품은 그림 1B에 표시된 직교 및 모듈식 방식으로 pEGFP-N1 벡터로 클로닝되었습니다. 합성 회로의 시뮬레이션은 SDHA와 테트라사이클린 억제기 모두에서 진동 역학을 드러냈습니다. 이 관찰은 주기적 파동 함수를 특징으로 하는 상호 표현 패턴을 제안합니다. SDHA 농도의 증가는 독시사이클린의 유도에 기인할 수 있으며, TetR의 발현은 독시사이클린의 수치 감소에 기인할 수 있습니다(그림 1C). 실리코(silico)에서 관찰된 SDHA 및 TetR의 유도성 진동 발현을 감안하여 pEGFP-N1 plasmid vector를 통한 synthetic circuit 전달 전략을 설계하고 구현했습니다.
이 연구에서 확인된 iGEM 부품에는 각각 TetO에 대한 BBa_K1493803, Kozak 서열에 대한 BBa_K4344028, TetR에 대한 BBa_C0040, P2A에 대한 BBa_K1537016이 포함됩니다. SDHA의 NCBI 등록 ID는 NM_025848입니다. 이러한 구성 요소는 총 1317개의 염기쌍에 걸쳐 있는 독시사이클린 유도성 TetON 합성 회로를 구성하기 위해 조립되었습니다(보충 파일 1). TetO는 DNA 조절 요소로 기능하기 때문에 그 염기서열은 번역되지 않았습니다. SDHA의 하류에 위치한 P2A의 5' TetR에서 3' 말단까지 확장되는 Kozak 염기서열의 다운스트림 서열은 번역의 인실리코(in silico ) 검증을 위해 선택되었습니다. 관찰 결과 내부 정지 코돈이 없는 것으로 나타났으며, 이는 전체 염기서열 길이에 걸쳐 중단 없는 번역을 보장했습니다(보충 파일 2). 1317 bp를 포함하는 합성 회로의 조절 부분은 EGFP의 5' 상류에 있는 NotI 및 XhoI 제한 부위 사이에 삽입되었습니다(그림 1B). 염기서열분석 결과는 삽입 서열이 플라스미드에 클로닝되었음을 강조합니다(보충 파일 3).
E. coli DH5α 균주에 면역 대사 회로를 도입하면 박테리아 형질전환 중 선택적 마커로 사용되는 항생제인 카나마이신에 대한 내성을 나타내는 형질전환된 콜로니가 성장했습니다. selection plate에서 형질전환된 콜로니의 풍부한 존재는 더 높았으며, 이는 competent cell이 transformation에 대한 높은 잠재력을 나타냈다는 것을 시사하며, 이는 사용된 형질전환 프로토콜의 효율성을 나타냅니다(그림 1D).
단일 콜로니를 분리하고 플라스미드 분리를 위해 카나마이신이 보충된 10mL의 LB에 파종했습니다. 10mL 배양에서 파생된 플라스미드 수율은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 이 절차에는 플라스미드 분리를 위한 표준 방법이 사용되었습니다. 완충액은 플라스미드 분리 전날 신선하게 준비되었으며, 배양 조건은 플라스미드 수율을 최대화하기 위해 최적화되었습니다. 얻어진 플라스미드 농도는 1 μg/μL를 초과하였으며, 260/280 및 260/230 비율은 각각 1.8 및 2.0을 초과하였다. 이러한 결과는 분리된 플라스미드가 순도가 높고 단백질, EDTA, 탄수화물 및 페놀과 같은 오염 물질이 없음을 나타냅니다.
고립된 합성 회로에 대한 전기영동 이동성 이동을 평가했습니다. 제한효소(restriction digestion)는 NotI 및 XhoI 제한효소(restriction enzymes)를 사용하여 수행하였는데, 이들 효소는 합성 회로가 삽입된 제한효소(restriction site)였다. 1% 아가로스 겔에서 두 개의 밴드, 1500bp 근처의 밴드, 4kb와 5kb 사이의 밴드가 관찰되었습니다. 인서트 크기가 1317bp인 경우 1500bp의 대역이 인서트에 해당할 수 있습니다. pEGFP-N1 벡터의 크기는 4.7kb입니다. 따라서 5kb에 가까운 대역은 pEGFP-N1 벡터로 추정됩니다. 결과적으로, 완전하고 온전한 합성 회로가 전달 벡터 내에 존재한다는 추론이 도출되었습니다. 또한, 분해되지 않은 intact synthetic circuit에 대해 약 6 kb band가 검출되었으며, 이는 pEGFP-N1 벡터가 plasmid vector 내에 거의 1.3 kb의 insert를 보유하고 있음을 나타냅니다(그림 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> 그림 1: 합성 회로의 설계 및 검증. (A) 유전 부분과 조절 구성 요소의 조립에 의한 합성 회로의 표현. (B) 100시간 단위에서 SDHA 및 TetR의 주기적 발현을 보여주는 결정론적 시뮬레이션 그래프. (C) 카나마이신에 내성이 있는 대장균 DH5α의 합성 회로 변형 콜로니. 단위는 결정론적 시뮬레이션이므로 100시간 단위입니다. (D) NotI 및 XhoI 제한 효소를 사용한 온전하고 제한 소화된 합성 회로의 아가로스 겔 전기영동. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>플라스미드 농도 (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 플라스미드 분리 후 얻은 합성 회로 구조체의 수율. 표는 μg/mL 단위의 플라스미드 농도, 260/280 및 260/230 비율을 보여줍니다.
대조군 및 감염된 세포에서 관찰된 형광 강도는 GFP에 대해 낮았습니다. 그러나 500 μg/mL G418을 1:1 비율로 사용한 합성 회로와 1 μg/mL dox를 사용한 유도를 사용한 합성 회로의 transfection은 IMT 세포에서 높은 GFP 발현을 유도하는 것으로 관찰되었습니다. 6시간 IMTI 세포에서는 GFP 발현이 IMT 샘플보다 낮았지만 GFP 발현도 유의하게 높았습니다(그림 2A, B). 또한, GFP 발현의 증가는 12시간 IMTI, 18시간 IMTI 및 24시간 IMTI 샘플에서 관찰되었다. 이러한 증가는 감염 시간의 증가에 기인할 수 있으며, 이는 거주 기생충17에 의해 대식세포에서 더 높은 대사 변화를 유도했을 수 있다. 세포 내 SDHA 수치는 감염 시간의 증가로 인해 영향을 받을 수 있다18. 이러한 IMTI 샘플에 dox가 보충됨에 따라 합성 회로를 통한 SDHA 수준이 증가하여 SDHA 발현이 증가했을 수 있습니다.
대식세포에 서식하는 기생충의 수를 확인하기 위해 DAPI 염색을 수행했습니다. 6 h L. 주요 감염 대식 세포에서 관찰 된 세포 내 기생충의 수는 대식 세포 당 6 개였으며, 이는 대식 세포 당 1-2 개의 세포 내 기생충이있는 6 시간 IMTI 샘플에 비해 높았습니다. transfection 및 dox induction 후, 감염 시점에 따라 세포 내 기생충 부하가 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다(그림 2C). 관찰 결과, 합성 회로가 SDHA 발현을 자극하여 기생충 제거 효과를 유도할 수 있음을 시사했습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> 그림 2: 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경. 대조군, 감염자, IMT 및 IMTI 샘플의 이미지. (A) 대조군의 경우 50μm, 6시간 감염 및 IMT의 경우 20μm, 6시간 IMTI의 경우 20μm, 12시간 IMTI의 경우 10μm, 18시간 IMTI, 24시간 IMTI의 스케일 막대를 사용한 모든 실험 샘플에서 GFP의 발현 분석. 사용된 채널은 모든 채널의 DIC, DAPI, GFP 및 병합 이미지였습니다. (B) GFP 발현에 대한 모든 실험 샘플(n=3)에 대한 Tukey의 보정 테스트를 사용한 일원 분산 분석(p &lt; 0.05가 유의한 것으로 간주됨) 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (C) (A) (n=3)의 샘플에 대해 100개의 대식세포 세포에서 기생충 부하에 대한 Tukey의 보정 테스트 분석을 사용한 일원 분산 분석을 수행했습니다(p &lt; 0.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
모든 샘플의 매체에서 IL-10 및 IL-12 수준을 검출한 결과, IL-10 및 IL-12의 농도는 감염 후 6시간에 가장 높았으며 24시간 감염 후 사이토카인 수치의 하향 조절이 이루어졌습니다. 합성 회로의 transfection 및 induction에서 IL-10 및 IL-12 수준에는 유의한 차이가 없었습니다. 또한 IMTI 시점 샘플에서 IL-10 및 IL-12 수준에는 유의하지 않은 차이가 있었습니다(그림 3). 6시간 감염된 샘플은 이미 IL-10 및 IL-1219,20의 발현을 나타내는 것으로 보고되었으며, IL-10 및 IL-12에서 유의하지 않은 차이를 관찰하여 다른 사이토카인에 대한 합성 회로의 효과를 조사하게 되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> 그림 3: IL-10 및 IL-12의 ELISA를 사용하여 서로 다른 샘플의 배지에서 분비 수준을 식별합니다. 샘플(n=2)에는 대조군, 6시간 감염, 24시간 감염, IMT, 6시간 IMTI, 12시간 IMTI, 18시간 IMTI, 24시간 IMTI가 포함됩니다. Tukey의 보정 검정 분석을 사용한 이원 분산 분석이 수행되었습니다(p &lt;.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에서 TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β의 전사체 수준을 검출한 결과, 감염 및 IMT 샘플에 비해 24시간 IMTI 샘플에서 TNF-α가 2.5배로 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 4). 24시간 IMTI 샘플에서 감염 및 IMT 샘플에 비해 IFN-γ 수치가 35배 증가하는 것이 관찰되었습니다. TGF-β 수치는 24시간 IMTI 샘플에서 1.5배까지 상당한 상향조절을 보였지만 상대적 접힘 변화는 TNF-α 및 IFN-γ에 비해 낮았으며, 이는 24시간 IMTI 샘플에서 전염증성 사이토카인이 유의하게 상향 조절되었음을 시사합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> 그림 4: 사이토카인의 qRT-PCR 분석. (A) TNF-α, (B) IFN-γ 및 (C) 6시간 감염, IMT 및 24시간 IMTI 샘플에 대한 TGF-β(n=2). Tukey의 보정 검정을 사용한 일원 분산 분석이 수행되었습니다(p &lt; 0.05가 유의한 것으로 간주됨). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 합성 회로를 형성하기 위해 조립된 유전 부분의 뉴클레오티드 서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: TetR, P2A 및 SDHA를 표현하는 합성 회로의 변환된 시퀀스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: pEGFP-N1 플라스미드에서 클로닝된 합성 회로의 염기서열분석 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단핵구는 활성화될 때 해당작용 대사에 의존하는 인간 선천성 면역 체계의 필수 구성 요소입니다. 우리는 신선한 전혈에서 총 단핵구 및 단핵구 하위 집단에 의한 포도당 수송체 발현 및 포도당 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석 프로토콜을 설명합니다.

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

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