Name: 설치류 척수에 광전자 장치 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: 배우세요 설치류 척수에 광전자 신경 프로브를 이식하고 고정하는 외과적 방법을. 측방 또는 중앙 절개술을 사용하여 수술 경험이 없는 연구자도 척수 회로를 탐구할 수 있습니다. 운동 기능 유지가 장치 안정성을 검증합니다.

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SS는 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 4년제 박사 펠로우십(Doctoral Fellowship)으로 부분적으로 자금을 지원합니다. AM은 캐나다 보건 연구소 (CIHR)의 캐나다 대학원 장학금 (석사)의 일부 지원됩니다. D.S.는 Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 캐나다 정부의 New Frontiers in Research Fund - Transformation(NFRFT-2020-00238)의 일부 자금 지원을 받았습니다. 그림 1 의 회로도는 Biorender.com 를 사용하여 생성되었으며 3D 모델은 sketchfab.com 의 허가를 받아 얻었습니다.

모든 절차는 캐나다 동물 보호 위원회(Canadian Council for Animal Care)의 지침에 따라 수행되었으며 브리티시 컬럼비아 대학교 동물 보호 위원회(University of British Columbia Animal Care Committee)의 감독을 받았습니다. 체중 350-450g, 생후 6-8개월의 암컷 Long-Evans 쥐는 집단 수용(21 °C; 12 h:12 h light cycle)하고 수술 전후에 표준 설치류 식단에 대한 임시 접근 권한을 부여받았습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 수술 전 준비
<ol><li>오토클레이브를 사용하여 모든 수술 도구를 멸균합니다.</li>
	<li>1L/min의 유속으로 산소로 전달되는 이소플루란(유도의 경우 5%, 유지의 경우 2%)으로 동물을 마취합니다.</li>
	<li>동물을 유도 챔버에서 가열 패드로 옮기고 즉시 이소플루란 노즈 콘을 연결합니다. 동물이 양쪽 다리의 발가락 꼬집기 반사가 완전히 소실되도록 하여 마취 수술 하에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>그림 2A와 같이 귀 밑에서 시작하여 쥐의 등을 면도합니다.</li>
	<li>멸균 안연고를 넉넉하게 바르고 부프레노르핀(0.03mg/kg으로 희석)과 10mL의 젖산 링거를 피하(체온으로 따뜻하게)합니다.</li>
	<li>면도 부위를 소독용 수술용 스크럽(클로르헥시딘)으로 닦은 다음 이소프로필 알코올을 면도 부위의 중심에서 시작하여 원 지름을 넓히면서 원을 그리며 닦습니다. 비누/알코올 과정을 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>동물을 입체 프레임에 고정하고 안정성을 위해 윤활 처리된 이어 바를 사용하여 머리를 배치합니다(그림 2A). 알림: 전체 절차 동안 일관되게 열 지원을 제공하고, 발가락 꼬집기 반사를 통해 마취 깊이를 확인하고, 활력 징후를 모니터링합니다.</li>
	<li>동물 위에 멸균 수술 드레이프를 놓습니다.</li>
</ol>2. 경추 척수 노출
<ol><li>멸균 겸자를 사용하여 두개골의 기저부를 촉진하는 것으로 시작합니다. 두개골 기저 근처에서 rostrocaudally 확장되는 눈에 띄는 가시 돌기를 느껴보십시오. 이것은 C214 입니다(그림 1B 및 그림 2B).</li>
	<li>C2에 대한 촉진을 진행하여 T215 로 식별되는 눈에 띄게 날카롭고 뾰족한 가시돌기를 찾습니다(그림 1B 및 그림 2C).</li>
	<li>메스를 사용하여 C2에서 시작하여 꼬리 쪽으로 약 1.5cm 동안 피부를 절개합니다(그림 2D). 참고: 절개 크기는 크기에 따라 동물에 따라 다를 수 있습니다. 해부학적 랜드마크를 미리 식별하고 그에 따라 진행하십시오.</li>
	<li>메스로 피하 지방층을 조심스럽게 잘라 아래에 있는 온전한 등쪽 근육 조직을 노출시킵니다.</li>
	<li>등쪽 근육이 노출되면 두 개의 Adson 겸자를 사용하여 정중선에서 떼어내어 둔한 절개를 수행합니다(그림 2E). 참고: 출혈을 최소화하기 위해 근육을 자르는 것보다 둔기 절개(근육 섬유를 잡아당기는 것)를 수행하는 것이 중요합니다. 등쪽 근육이 적절하게 노출되면 공 모양의 근육이 드러납니다(그림 2G). 이 근육은 C2를 완전히 덮고 C3를 부분적으로 덮습니다.</li>
	<li>롱거와 멸균 겸자를 사용하여 절개 부위의 꼬리 피부 플랩을 즉시 들어 올립니다. rongeurs를 사용하여 작은 피하 주머니를 만듭니다 - 이것이 장치의 위치입니다 (그림 2F). 알림: 피하 포켓은 장치 자체보다 커야 합니다. 외과의는 피하 주머니를 열 때 통제력과 가시성을 향상시키기 위해 동물을 앞쪽으로 향하도록 위치를 변경하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>견인기를 놓아 척추를 노출시킵니다(그림 2G).</li>
	<li>롱거를 사용하여 척추뼈를 덮고 있는 남아 있는 근육이나 조직을 제거하고 척수 분절을 식별하기 시작합니다. 공 모양의 근육의 바로 꼬리는 C4이고 그 다음은 C5와 C6입니다(그림 2G-I). 완료되면 수술 부위를 멸균 식염수로 헹구고 멸균 거즈로 건조시킵니다. 알림: 공 모양의 근육은 C2를 완전히 감싸고 부분적으로 C3 위로 뻗어 있습니다. 척수 분절은 최소한의 접촉으로 직접 꼬리 부분에 있으며 C4로 지정됩니다.</li>
	<li>프로브의 의도된 목적에 따라 박판 절제술을 수행합니다.<ol><li>라미나 아래의 프로브의 경우 C5 및 C6에서 측면 후궁 절제술을 수행하여 향후 프로브 배치를 위해 라미나에 측면화된 개구부를 만듭니다(그림 2H, 보충 그림 1A).</li>
		<li>라미나 위에 프로브를 배치하기 위해 C5의 내측 후궁 절제술을 수행하여 가시돌기의 측면 측면을 제거하지 않고 프로브 배치를 위한 내측 경로만 노출하도록 합니다(그림 2I, 보충 그림 1B).</li>
		<li>후궁 절제술 후 멸균 식염수로 해당 부위를 헹구고 멸균 거즈로 건조시켜 뼈 부스러기를 제거합니다. 알림: 후궁 절제술을 수행할 때 탯줄의 손상을 방지하기 위해 롱거를 뼈에 대고 아래로 움직이지 않도록 하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 장치의 경막외 배치
<ol><li>플라스틱 팁 멸균 겸자(그림 3A)로 멸균 장치를 잡고 2.9단계 이전에 만든 피하 개구부 안으로 밀어 넣습니다. 알림: 장치 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균되지 않은 장갑/도구로 장치를 만지지 않는 것이 중요합니다. 장치 배치 및 피부 아래의 위치를 위해 지정된 멸균 겸자를 사용하십시오.</li>
	<li>장치를 인접 근육 층에 봉합하거나 붙여서 안전하게 보관합니다(그림 3B). 알림: 장치를 근육에 봉합하는 경우 흡수되지 않는 봉합사를 사용하십시오. 그렇지 않으면 장치가 신체에서 봉합사 흡수 후 움직이기 쉽습니다. 접착제를 사용하는 경우 접착제/접착제의 장기적인 안정성과 생체 적합성을 확인하십시오. 신뢰할 수 있는 고정 지점을 보장하기 위해 장치를 피하 지방/지방층에 고정하지 마십시오.<ol><li>이 단계를 진행하기 전에 장치 본체 위치를 계획합니다. 장치는 영구적으로 고정되기 때문에 장치가 척수에서 원하는 높이에서 너무 가깝거나 너무 멀리 있는 경우 프로브 배치(3.4단계)에 문제가 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>견인기를 척수 주위에 놓고 적절한 창을 열어 척수에 프로브를 놓습니다.</li>
	<li>프로브 배치:<ol><li>라미나 아래의 프로브 배치: 5 및 C6 라미 아래에 플라스틱 팁 집게를 사용하여 프로브를 2.9.1단계에서 만든 측면 채널을 통해 밀어 넣어 조심스럽게 삽입합니다(그림 3D).</li>
		<li>척수 위의 프로브 배치:<ol><li>플라스틱 팁 집게를 사용하여 프로브를 조정하여 프로브 팁을 5단계에서 2.9.2단계에서 만든 내측 창 위에 정렬하고 배치합니다(그림 3C).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>멸균되고 작으며 바람직하게는 세라믹 용기에 치과용 시멘트 분말 1스쿱, 하이테크 그리스 3방울, 촉매 1방울을 혼합하여 시멘트를 준비합니다. 점성이 있는 농도가 될 때까지 멸균 이쑤시개와 섞습니다. 알림: 수술을 수행하지 않는 한 사람이 시멘트를 준비하여 외과의가 프로브를 제자리에 고정하고 시멘트를 적용하기 직전에 원하는 부위를 건조시킬 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 이 단계는 시간에 민감합니다. 외과의가 시멘트를 준비하기 전에 프로브의 위치를 지정했는지 확인하십시오. 일단 촉매가 적용되면 지연이 있을 경우 시멘트가 너무 두꺼워져 뼈와 효과적으로 결합할 수 없습니다. 프로브/뼈에 시멘트를 놓기 전에 적절한 일관성을 얻기 위해 수술 전에 시멘트로 연습하십시오.</li>
	<li>척추뼈의 의도된 접합 부위를 완전히 건조시켜 신뢰할 수 있는 앵커 포인트를 만듭니다. 프로브 끝에 치과용 시멘트 1-2방울을 바르고 의도한 척추 수준(이 경우 C4) 위에 놓아야 합니다(그림 3C,D). 알림: 접합하기 전에 척추뼈를 가능한 한 건조시키는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 시멘트가 부착되지 않고 프로브가 고정되지 않습니다.</li>
	<li>30초 동안 일시 중지하고 시멘트를 부드럽게 만져 경화되었는지 확인합니다.</li>
	<li>시멘트가 완전히 경화되지 않으면 20초 더 기다렸다가 프로브가 뼈에 단단히 고정될 때까지 갓 만든 시멘트를 다시 바릅니다. 알림: 시멘트는 만졌을 때 딱딱하고 뻣뻣해지면 제대로 접착된 것입니다. 주의: 시멘트가 너무 액체일 때 바르면 척추뼈 사이의 척수 조직으로 스며들 수 있습니다. 이 경우 시멘트가 껌과 같은 농도로 두꺼워질 때까지 약 10초 동안 기다렸다가 집게를 사용하여 척수와 접촉한 시멘트를 부드럽게 제거합니다.</li>
</ol>4. 수술 후 절차
<ol><li>수술이 완료되면 5-0 vicryl 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 동물을 입체 장치에서 부드럽게 제거하고 가열된 회수 챔버로 옮깁니다. 수술 후 처음 3-5일 동안은 동물에게 부드럽고 촉촉한 차우, 간식 및 하이드로겔 물을 제공하십시오.</li>
	<li>수술 후 첫 주에는 하루에 두 번 동물을 철저히 모니터링하십시오. 부프레노르핀과 따뜻하게 된 젖산 링거 주사를 다음 2일 동안 매일 두 번 투여하거나 통증 징후가 지속되는 경우 더 오래 투여합니다. 동물이 임상적 건강 문제를 보이지 않을 때까지 매일 검사를 계속하십시오. 그 후, 적어도 일주일에 한 번은 동물을 확인하십시오.</li>
	<li>(선택 사항) 수술 후 피부의 장치 둘레를 윤곽을 그리고 절개 봉합 후 신체의 장치 위치를 시각적으로 표시합니다(그림 4A). 알림: 이 단계는 안테나 커플링이 중요한 외부 송신기를 통해 무선으로 전원을 공급해야 하는 장치 또는 스킨16,17,18을 통해 다시 채워야 하는 약물 전달 펌프와 같이 장치에 외부 액세스가 필요한 경우에 특히 유용합니다.</li>
</ol>

설치류의 척수 수술 및 광학 생크 이식

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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

척수의 신경 조절 및 치료적 중재는 종종 정밀하고 표적화된 세그먼트 3,4,7,13에 프로브를 배치해야 합니다. 척수의 고유한 이동성을 감안할 때, 만성 연구를 가능하게 하기 위해 프로브를 안정적으로 고정해야 합니다. 특정 응용 분야에 따라 프로브가 척수와 물리적으로 접촉하는지 또는 가능한 경우 염증 조직 반응을 줄이기 위해 접촉을 줄일 수 있는지 여부를 제어하는 것이 중요할 수 있습니다. 따라서, 두 가지 방법 각각에 대한 수술 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 C5에서 척수의 경추 분절에 프로브를 배치하는 방법을 구체적으로 설명합니다. 그럼에도 불구하고, 척수의 T2 또는 T10에 대해 설명된 랜드마크를 사용하여, 프로브는 일단 노출된 척추뼈를 각각 T2 또는 T10에서 카운트다운함으로써 흉추 또는 요추 부위의 정확한 위치에 유사하게 배치될 수 있습니다. 또한 척수 조직 손상을 최소화하기 위해 연결된 프로브에 비해 더 크고 단단한 장치 본체를 척수에서 떨어진 피하 공간에 고정했습니다.
프로브와 결합된 장치를 이식하는 데에는 몇 가지 중요한 점이 있습니다. 첫째, 프로브를 접합하기 전에 장치 본체의 위치를 결정하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 프로브 팁과 장치 본체 사이의 거리가 최적화되어 프로브의 장력을 줄이고 예를 들어 프로브 비틀림 또는 변위를 유발할 수 있는 추가 프로브 길이를 방지할 수 있습니다. 기본적으로 목표는 프로브의 길이가 장치 본체가 배치되는 피하 공간에서 프로브가 접합되는 대상 척수 영역까지의 거리와 유사하도록 하는 것입니다. 다양한 프로브 길이를 테스트하는 말단 수술 절차를 수행함으로써 대상 세그먼트에 대한 최적의 크기를 결정할 수 있습니다.
무균 상태를 유지하려면 피하 포켓에 삽입하는 동안 피부 바깥층에 닿지 않도록 장치를 조심스럽게 다루어야 합니다. 이러한 접촉은 장치의 멸균 상태를 손상시켜 잠재적으로 수술 후 감염으로 이어질 수 있습니다. 또한, 일반적으로 얇은 보호, 절연 및 멸균 층인 코팅(20,21)의 손상을 방지하기 위해 겸자로 장치를 잡을 때 장치에 가해지는 힘의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 코팅을 제거하는 것은, 예를 들어ample, 회로를 단락시키거나, 동물에게 전기 충격을 일으키거나, 신체에 염증 반응을 유발함으로써 장치의 수명을 크게 단축시킬 수 있습니다. 플라스틱 팁 집게로 장치를 다루면 이러한 합병증을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
장치를 연조직에 봉합할 때 피하 지방 조직에 봉합하지 않는 것이 중요합니다. 예비 시험에서 관찰된 바와 같이, 지방층은 파열되기 쉽기 때문에 봉합사를 위한 신뢰할 수 있는 고정 지점이 아닙니다. 대신, 장치를 신체에 영구적으로 배치하기 위해 비흡수성 봉합사를 사용하여 장치 본체를 피하 공간의 인접한 근육층에 봉합했습니다. 반면에, 프로브를 가시 공정에 고정할 때, 시멘트를 적용하기 전에 프로브가 고정되는 부위가 건조한지 확인하는 것이 중요합니다. 젖은 뼈/프로브는 경화 시간을 연장하고 공정이 완전히 실패할 수 있습니다.
이식 수술 전에 신중하게 해결해야 하는 이식형 장치와 관련된 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. (1) 장치의 전기적으로 활성화된 부분은 절연 패시베이션 층으로 캡슐화되어야 합니다. 부동태화 층의 결핍은 장치 기능 장애를 유발할 수 있습니다. (2) 이식 가능한 제품은 시설 동물 프로토콜에 따라 철저히 멸균되어야 합니다. (3) 장치와 신경 프로브 또는 자극 생크 사이의 접합부는 단단히 형성되어야 합니다. 연결은 끊임없는 동물의 움직임으로 인해 반복 가능한 기계적 스트레스를 겪습니다. (4) 장치에 부착된 신경 프로브 또는 자극 생크는 다양한 지점에서 끊어지는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 유연하고 신축성이 있어야 합니다.
설명된 프로토콜은 다양한 크기의 동물 모델에 장치를 이식하도록 확장될 수 있습니다. 해부학적 랜드마크를 확인한 후, 설명된 수술 방법을 체계적으로 맞춤화하여 척수의 표적 분절에 신경 프로브 또는 자극 생크를 고정하고 관련 제어 모듈을 이식할 수 있습니다. 그러나 응용 프로그램에 따라 다른 장치는 이 문서에 이식된 것과 다른 크기, 재료 및 두께를 가질 수 있습니다. 예를 들어, 외부 제어 모듈에 연결된 장치에는 추가 고려 사항이 필요합니다. 또한 이 프로토콜은 광유전학적 자극에 맞게 조정되었지만 약물 전달 또는 전기 자극/기록과 같은 다른 신경 조절 응용 분야에는 약간 다른 수술 절차가 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 특히, 이러한 응용 분야는 경막하 7 아래의 척수와의 직접 접촉을 보장하기 위해 경막하 이식이필요합니다. 그러나, 광유전학의 경우, 설치류 경막이 광 침투를 크게 방해하지 않기 때문에 조직과의 긴밀한 접촉은 일반적으로 불필요하며, 이로 인해 광원이 경막외로 배치될 수 있다10.

척수는 운동 행동을 조정하는 것부터 호흡과 같은 항상성 과정을 조절하는 것까지 다양한 필수 중추 신경계 기능을 촉진합니다 1,2. 척수를 가로지르는 정교한 회로 네트워크의 역할을 규명하기 위해서는 전기 자극, 기록, 약물 전달 또는 표적 부위에 대한 광학 자극을 위한 인터페이스가 필요하다 3,4,5,6. 이러한 검사를 가능하게 하는 장치가 개발되었지만7,8,9,10,11 척수에 만성적으로 이식하기 위해서는 전문적인 수술 기법이 필요하다 4. 특히, 척수 및 관련 척추뼈는 신장 및 굽힘과 같은 자연스러운 움직임으로 인한 기계적 변형에 대한 민감성을 증가시켰다 8,12,13. 척수의 이러한 고유한 특성으로 인해 이식된 프로브가 장기간에 걸쳐 특정 세그먼트에서 안정적이고 기능적이며 고정된 상태를 유지하는 것이 본질적으로 어렵습니다.
여기에서, 척수의 표적 분절에 광학 섕크를 삽입하고 고정하기 위한 수술 프로토콜이 설명되어 있습니다(그림 1A). 특히 자궁경부 부위와의 접촉은 독특한 문제점을 야기하는 것으로 나타났기 때문에9 이식 단계는 C5 자궁경부 부위에 대해 구체적으로 입증되었다. 경추의 복잡성은 더 깊은 위치와 근육 조직의 풍부함에서 비롯되며, 이는 척수의 나머지 부분을 따라 두드러지지 않는 특성입니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에 설명된 절차는 다양한 척수 부위의 수술에 적용할 수 있도록 설계되었습니다. 피부에서 식별할 수 있는 뚜렷한 해부학적 "랜드마크"를 사용하여 척수 분절을 찾고 식별하기 위한 단계적 지침이 제공됩니다(그림 1B). 그런 다음 프로토콜은 외과적 이식을 위한 두 가지 기술, 즉 척수와의 직접 접촉이 필요한 프로브에 맞춤화된 기술과 직접 접촉이 필요하지 않을 수 있는 프로브에 대한 기술을 설명합니다. 설명된 단계는 설치류 생존 수술 교육을 받은 모든 연구원이 재현할 수 있도록 설계되었습니다.
이 프로토콜에는 C5 경추 수준에 유연한 광학 생크가 부착된 광전자 장치(18mm x 13mm)를 이식하기 위한 단계별 지침이 포함됩니다. 이식 가능한 장치는 C5의 꼬리 부분에 피하로 고정되며 척수 광학 자극이 발생할 때 켜지는 마이크로 스케일 발광 다이오드(μLED) 표시기로 구성되어 장치 기능에 대한 실시간 피드백을 제공합니다. 임플란트된 광학 생크가 자연 운동 기능에 미치는 영향을 임플란트를 받은 설치류를 대상으로 평가하고 가짜 수술을 받은 설치류와 비교했습니다. 결과는 프로브가 이식 후 7일 후에 동물의 자연적인 뒷다리 및 앞다리 기능에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>애드슨 펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Alm 3 포인트 리트랙터</td><td>Fine Science Tools</td><td>17010-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine / Vetergesic&nbsp;</td><td>CDMV</td><td>124918</td><td>제조업체는 0.3 mg/mL를 제공하지만 쥐에서 사용하기 위해서는 0.03 mg/kg으로 희석해야 합니다.</td></tr><tr><td>Chlorhexidine 2% 용액</td><td>Partnar</td><td>PCH-020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 긴 지혈성 집게</td><td>KaamKaaj Tools</td><td>14.5</td><td>곡선형 긴 지혈성 집게와 스테인리스 스틸 래칫 잠금 핀셋</td></tr><tr><td>CVD 파릴렌 기계: SCS Labcoter 2</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>PDS 2010</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트 - 촉매&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>S371</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트 - Metabond</td><td>Parkell, Inc</td><td>S398</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트 - 파우더&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>S396</td><td></td></tr><tr><td>펜치와 교체 가능한 플라스틱 팁</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11980-13</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Fresenius Kabi&nbsp;</td><td>CP0406V2</td><td>정밀 기화기를 통해 유도 5%, 유지 보수를 위해 2%로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올 70%</td><td>McKesson</td><td>350600</td><td></td></tr><tr><td>Lacri-Lube 멸균 눈 연고&nbsp;</td><td>새로 고침&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Evans Rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>저온 솔더 페이스트</td><td>Chip Quik Inc.</td><td>11.38</td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>방사형 자석, Inc.</td><td>0.53</td><td>자석 네오디뮴 철 붕소 (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm)</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 바늘 홀더와 봉합 커터&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PDMS: 실가드&nbsp; 184</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>솔더 플럭스</td><td>Chip Quik Inc.</td><td>14.25</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments</td><td>모델 900</td><td></td></tr><tr><td>멸균 Kwik-Sil 접착제</td><td>세계 정밀 기기</td><td>KWIK-SIL-S</td><td></td></tr><tr><td>UV 손전등</td><td>Vansky</td><td>19.99</td><td></td></tr><tr><td>무선 충전기</td><td>Nilkin</td><td>NKT06</td><td></td></tr><tr><td>무선 충전 코일</td><td>TDK Corporation</td><td>WT202012-15F2-ID</td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 척수에 광전자 장치 이식

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

신경 조절은 진단, 조절 및 치료 응용 분야를 제공할 수 있습니다. 뇌에 대한 광범위한 연구가 이루어졌지만, 척수의 조절은 상대적으로 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 선천적으로 섬세하고 이동성이 뛰어난 척수 조직은 신경 프로브의 정확한 이식을 어렵게 만드는 제약을 가합니다. 신경 조절 장치, 특히 유연한 생체 전자 장치의 최근 발전에도 불구하고 장치 이식의 외과적 복잡성으로 인해 척수에서 사용을 확대할 수 있는 기회는 제한되어 있습니다. 여기에서 우리는 설치류의 척수와 인터페이스하는 맞춤형 광전자 장치의 이식을 위해 특별히 맞춤화된 일련의 수술 프로토콜을 제공합니다. 두 가지 다른 외과적 이식 방법을 통해 척수의 특정 부분에 광학 생크를 배치하고 고정하는 단계가 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 광학 자극을 위해 척수와의 직접적인 접촉이 필요하거나 필요하지 않을 수 있는 다양한 장치 및 응용 분야에 최적화되어 있습니다. 방법론을 명확히 하기 위해 피부를 절개하기 전에 눈에 띄는 랜드마크를 식별하기 위해 먼저 척추 해부학을 참조합니다. 설치류에서 경추 위에 광학 생크를 고정하는 수술 단계가 시연됩니다. 그런 다음 광학 생크에 연결된 광전자 장치를 척수에서 떨어진 피하 공간에 고정하여 불필요한 직접 접촉을 최소화하기 위한 절차를 간략하게 설명합니다. 임플란트를 이식받은 동물과 가짜 수술을 받은 동물을 비교한 행동 연구에 따르면 광학 생크는 이식 후 7일 동안 뒷다리 또는 앞다리 기능에 부정적인 영향을 미치지 않았습니다. 본 연구는 다양한 척수 중재술을 조사하기 위한 향후 연구에 사용할 수 있도록 신경 조절 툴킷을 확장합니다.

보충 그림 2에 표시된 상세한 기능 다이어그램을 가진 광전자 장치를 4 마리의 Long Evans 쥐에 이식했습니다. 보충 그림 3은 이식할 준비가 된 최종 광전자 장치를 보여줍니다. 다른 3마리의 동물은 장치 이식 없이 C5에서 내측 후궁 절제술을 포함하는 가짜 수술을 받았습니다. 광전자 장치는 팁에 μLED가 내장된 유연한 프로브로 구성되었으며, 통합 LED 드라이버에 의해 활성화되었습니다. LED 드라이버는 프로그래밍 가능한 펌웨어가 있는 마이크로 컨트롤러에 의해 제어됩니다. 또한 피부 바로 아래의 근육층에 봉합된 장치 본체로 구성되었습니다. 파릴렌-C(~10μm) 층은 화학 기상 증착(CVD)을 사용하여 전체 장치에 증착됩니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)(~800μm)의 두 번째 층은 광전자 장치 본체(보충 그림 3)를 덮어 조직과 부드러운 계면을 형성했습니다. 프로브 팁은 μLED가 C5 위에 떠 있는 상태에서 C4에 고정되었습니다. 장치 기능의 실시간 검증을 위해 광학 섕크의 μLED와 동시에 켜지는 μLED 표시기(피부 아래에서 빛을 볼 수 있음)가 장치에 사용되었습니다. 시간이 지남에 따라 동물의 수행 능력에 대한 지속적인 신뢰성을 확인하기 위해 수술 후 7일 동안 동물을 모니터링했습니다(그림 4B).
동물의 운동 기능은 Martinez open-field locomotor rating scale19를 사용하여 평가하였다. 개방 필드 행동을 평가하기 위해 치료 그룹에 대해 알지 못하는 두 명의 훈련된 관찰자가 수술 전과 수술 후 3일, 5일, 7일째에 테스트를 수행했습니다. 데이터 수집 후, 임플란트 그룹과 가짜 그룹 간의 앞다리 및 뒷다리 점수에 대한 각 시점의 차이를 결정하기 위해 Mann-Whitney U 테스트를 수행했습니다. 우리의 분석은 7일째까지 임플란트 및 가짜 그룹에서 유사한 앞다리 기능 점수를 나타냅니다(그림 5A). 마찬가지로, 모든 시점에서 뒷다리 점수에 대한 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 없었습니다(그림 5B).
사후 검증은 프로브와 장치 본체가 제자리에 남아 있었는지 확인하기 위해 이식 후 7일 후에 수행되었습니다. 봉합사 또는 장치의 눈에 띄는 분리가 발견되지 않았습니다. 또한, 장치 본체를 잡아당겨도 조직에서 분리되지 않았습니다(보충 그림 4A). 그런 다음 이전에 절제하고 봉합한 근육을 척수 위에 노출시켰고, 프로브가 척수 위에 단단히 접합된 상태로 유지되었음을 확인했습니다(보충 그림 4B). 장치 본체와 유사하게, 프로브 헤드는 프로브-라미나 기계 접합부에 대한 부착을 평가하기 위해 접합 지점에 대해 연속적으로 뒤로 당겨졌습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig01.jpg"> 그림 1: 장치 이식 및 해부학적 랜드마크에 대한 개략 도. (A) 척수 위에 프로브를 배치하고 장치를 피하 배치하는 것을 보여줍니다. (B) 척수 수준을 결정하는 데 사용되는 랜드마크를 나타내는 3D 모델. C2, T2 및 T10 가시 돌기는 참조용으로 표시됩니다. 더 어두운 색상은 해당 수준을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig02.jpg"> 그림 2: 척수를 노출시키고 피하 주머니를 준비하는 모습. (A) 입체는 동물에 위치합니다. (B) C2 가시돌기 및 (C) T2 가시돌기는 촉진 을 통해 확인됩니다. (D) 피부와 피하 지방층을 절개하여 자궁 경부 수준의 관심 지점에서 등쪽 근육을 노출시킵니다. (E) 등쪽 근육의 둔한 절개를 통해 경추가 노출됩니다. (F) 이식 가능한 장치 꼬리를 절개 부위에 고정하기 위해 피하 포켓이 생성됩니다. (G) 경추와 공 모양의 근육을 노출시키기 위해 적절한 절개 후 견인기를 배치하여 C2를 완전히 덮고 C3를 부분적으로 마스킹합니다. 점선은 공 모양의 근육을 나타냅니다. 경추 척수가 노출되면 (H) 척추 아래 프로브 배치를 위해 C5 및 C6에서 두 개의 외측 박막 절제술을 수행하거나 (I) 척추 뼈 위에 프로브를 배치하기 위해 C5에서 내측 후궁 절제술을 수행합니다. 별표는 외측 후궁 절제술 부위를 나타냅니다. 축척 막대 = 3mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig03.jpg"> 그림 3: 장치 주입 및 프로브 배치. (A) 장치를 피하 포켓에 넣습니다. (B) 장치가 근육 조직에 봉합됩니다. (C) 프로브는 내측 후궁 절제술을 받은 C5 층판 위에 고정됩니다. (D) 장치는 측면 후궁 절제술을 받은 C5 및 C6 라미나 아래에 배치됩니다. (C)와 (D) 모두에서 프로브의 팁은 손상되지 않은 C4에 접합됩니다. 축척 막대 = 3mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig04.jpg"> 그림 4: 수술 후 장치 마킹 및 기능 확인. (A) 장치의 위치는 수술 후 쉽게 식별할 수 있도록 봉합 후 피부 위에 선택적으로 표시할 수 있습니다. (B) 그림은 이식 후의 동물을 묘사합니다. 피부 아래에서 볼 수 있는 표시기 μLED를 관찰하여 장치의 기능을 검증하고 장치의 성공적인 작동을 확인했습니다(동물의 오른쪽에 있는 범프는 장치 본체가 이식된 곳임). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig05.jpg"> 그림 5: Martinez는 시간 경과에 따른 앞다리 및 뒷다리 성능에 대한 가짜 및 임플란트 그룹의 오픈 필드 행동 점수. 이 플롯은 이식 후 0(기준선), 3일, 5일, 7일(DPI)의 네 가지 시점에 걸쳐 (A) 앞다리 및 (B) 뒷다리 개방 필드 평가에 대한 평균 행동 점수를 보여줍니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. 가짜 그룹과 임플란트 그룹 간의 유의미한 차이(p &lt; 0.05)는 특정 시점에서 별표(*)로 표시됩니다. 그림 범례는 점선으로 표시된 가짜 그룹을 나타내고 임플란트 그룹은 실선으로 표시됩니다. 가짜 표본 크기는 n = 3이었고 임플란트는 n = 4였습니다. 비모수 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 각 시점에서 그룹 간 차이의 유의성을 평가했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 후궁 절제술의 그림. 점선은 (A) 척추 아래 프로브 배치를 위한 두 개의 측면 박판 절제술과 (B) 척추 위에 프로브 배치를 위한 내측 후궁 절제술을 위해 절제할 영역을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 광전자 장치의 개략도. 장치의 자세한 블록 다이어그램이 표시됩니다. 왼쪽 상단 블록은 무선 전력 수신기 안테나 공진 LC 탱크를 나타냅니다. 수신된 전력은 정류되어 저드롭아웃 전압 레귤레이터(LDO)에 공급됩니다. 마이크로 컨트롤러 장치는 프로그래밍된 파라미터에 따라 장치를 자동으로 활성화하고, LED 드라이버는 프로브에 내장된 모든 μLED에 전력을 공급합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 광전자 장치. 생체 적합성 캡슐화가 있는 최종 광전자 장치로, 팁에 1μLED로 구성된 광학 섕크에 연결됩니다. 점선 사각형은 μLED의 위치를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 장치 안정성에 대한 사후 검증. 이식 후 7일 후, (A) 장치 본체는 이식된 것과 동일한 위치에서 근육 조직에 봉합된 상태로 유지되었고, (B) 접합된 프로브는 C4 라미나 위에 고정된 상태로 유지되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 척수 수술을 수행하고 설치류의 척수 위에 광학 생크를 이식하고 고정하기 위한 수술 절차를 자세히 설명합니다.

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Research

연구

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Neuroscience

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출처: Pietruczyk, E. A., et al. 마우스의 추궁 절제술 및 척수 창 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 척수 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 붕규산 커버 유리와 3D 프린팅 백플레이트를 사용하여 노출된 척수를 안정화합니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 2광자 현미경을 사용하여 혈액-뇌 장벽 역학 및 신경혈관 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

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