질량분석법을 사용한 인간 뇌 오가노이드의 분자 이미징

우리는 발달 중인 인간 뇌의 대사체학을 연구했습니다. 생체 내에서 조사하는 도전. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 시험관 내 뇌 오가노이드 모델과 고급 특수 대사체학 기술을 사용합니다.

최근 몇 년 동안 오가노이드 특성화를 위해 고급 마스터 기술 기반 기술이 빠르게 적용되었으며, 이러한 추세는 계속될 것으로 예상됩니다. 질량 분광 이미징 또는 MSI를 사용한 최근의 대사체 연구는 희귀 질환을 포함하여 인간 발달 및 질병의 분자 메커니즘을 이해하고 맞춤형 의학에 적용하는 데 있어 오가노이드 모델의 이점을 보여줍니다. 분자 이미징 중에 오가노이드의 분자 무결성과 형태를 유지하는 것은 어려운 일이며 정확한 샘플 처리 및 준비가 필요합니다. 이를 해결하기 위해 뇌 오가노이드의 고해상도 다중 MALDI MSI 분석을 위한 특수 기술이 개발되었습니다. 이미징 조건, 입학, 조직 보존 사이의 질량 스펙트럼을 최적화하여 신뢰할 수 있는 고품질 데이터를 보장합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 고해상도 MSI 잠재력을 보여주며, 연구자에게 이러한 기술을 최대한 활용하여 오가노이드의 대사체 지형을 자세히 조사하는 데 필요한 리소스를 제공합니다.

우리의 연구는 뇌 오가노이드의 특정 세포 유형과 관련된 대사 산물인 신경 발생에 대한 우리의 이해를 발표할 것입니다. 이 상세한 대사 프로파일링은 뇌 발달에서 이러한 대사 산물의 규칙을 밝힐 뿐만 아니라 신경 발달 장애를 모방한 치료 개입의 잠재적 표적을 식별합니다.

[해설자] 시작하려면 유도만능줄기세포에서 파생된 뇌 오가노이드가 들어 있는 플라스크를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 넓은 구경 팁을 사용하여 플라스크에서 접시로 오가노이드를 옮깁니다. 염화칼슘 없이 DPBS로 오가노이드를 세 번 세척하고 염화마그네슘을 세척하여 배지를 헹굽니다. 그런 다음 증류수로 빠르게 헹구어 DPBS에서 염분을 제거합니다. 차가운 생선 껍질에서 얻은 젤라틴 10mg을 DPBS 100밀리리터가 들어 있는 플라스크에 넣습니다. 혼합물을 섭씨 70-80도에서 2시간 동안 가열하고 저어줍니다. 그런 다음 용액을 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 옮겨 기포를 제거합니다. 작은 피펫 팁을 사용하여 플라스틱 몰드 중앙에 오가노이드를 고정합니다. 오가노이드가 완전히 잠길 때까지 10% 젤라틴 포매 용액을 금형에 부드럽게 붓습니다. 드라이아이스에 차가운 100% 에탄올이 담긴 페트리 접시에 틀을 넣습니다. 색상이 단백색으로 변하는 것으로 입증되는 완전히 얼면 페트리 접시에서 오가노이드 젤라틴 블록을 제거합니다. 블록을 알루미늄 호일로 싸거나 주석 컵에 넣습니다. 극저온 절편이 준비될 때까지 블록을 밀봉하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 냉동 절편을 위해 섭씨 영하 20도로 설정된 냉동 챔버 내에 오가노이드를 포함하는 플라스틱 블록을 10-15분 동안 놓습니다. 그런 다음 냉동계에서 오가노이드를 14마이크로미터 섹션으로 절편하고 질량 분석 이미징 또는 MSI를 위해 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드에 장착합니다. 이미징할 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 시작하려면 뇌 오가노이드 절편이 장착된 인듐 주석 산화물 코팅 슬라이드를 섭씨 영하 80도에서 제거합니다. 슬라이드를 건조기에 20분 동안 넣어 표면의 대기 중 물의 응결을 최소화합니다. 건조 후 가열된 공압 분무기를 사용하여 70% 메탄올에 10밀리리터당 70mg의 NEDC를 오가노이드 절편에 분사합니다. 뇌 오가노이드 대사산물을 시각화하기 위한 고해상도 MALDI MSI 플랫폼을 달성하기 위해 이중 이온 깔때기 인터페이스가 있는 이온 소스를 질량 분석기에 장착합니다. 349나노미터 파장, 1킬로헤르츠의 반복률, 약 1.3-1.4마이크로줄의 펄스 에너지를 가진 연결된 Q 스위치 주파수 3배 ND 레이저를 사용하십시오. 오버샘플링을 방지하려면 직경이 약 15마이크로미터인 스폿 크기에 레이저를 집중시키십시오. 샘플을 MALDI 인젝터 스테이지에 부착합니다. 고압 이온 깔때기는 7.4 - 7.5 Torr, 저압 이온 깔때기는 1.6 - 1.8 Torr에서 작동 및 유지 관리하십시오. 191볼트 피크에서 780킬로헤르츠의 무선 주파수 전압을 가하여 저압까지, 80볼트에서 604킬로헤르츠를 피크까지 고압 이온 깔때기에 적용합니다. 저질량 범위에서 작은 대사산물에 대한 민감도를 향상시키려면 MALDIDMSI 소스의 저압 및 고압 깔때기의 RF 진폭을 각각 약 20% 및 15%로 줄입니다. 질량 해상도를 70,000으로 설정합니다. 그런 다음 영역과 픽셀 크기를 픽셀당 25마이크로미터로 선택합니다. 음이온 및 양이온 모드 모두에서 마스터 충전 범위를 80에서 900 사이로 설정합니다. 자동 게인 제어를 끈 상태에서 주입 시간을 250밀리초로 설정하고 프로파일 모드에서 퓨리어 변환 질량 스펙트럼을 획득합니다. 질량 분석 스펙트럼 데이터를 호환되는 소프트웨어로 직접 가져옵니다. 컨볼루션 알고리즘을 사용하여 기준선 보정을 수행하고 총 이온 수를 사용하여 데이터를 정규화합니다. 질량 결함 및 픽셀 커버리지를 기반으로 마스터 전하 비율 이미지를 구별하기 위해 0.01 또는 5:00 PPM과 같은 델타 마스터 전하의 빈 너비를 사용하여 원시 데이터 파일에서 이온 이미지의 기능 목록을 생성합니다. 개별 대사 산물 이온 종에서 거짓 색상 또는 RGB 이미지를 생성합니다. 대사 산물을 식별하기 위해 MALDI MSI에서 얻은 원시 데이터 파일의 마스터 전하비 목록을 인간 대사 종양 데이터베이스에 업로드합니다. 60일 인간 뇌 오가노이드의 크렙스 주기 관련 대사산물은 생선 젤라틴 포매가 있는 MSI를 사용하여 공간적으로 매핑되었습니다.