이미징과 전기생리학을 결합하여 마우스의 확산 탈분극을 시각화하고 기록합니다.

본 연구의 범위는 뇌 모델을 사용하여 확산되는 탈분극과 경미한 외상성 뇌 손상 사이의 관계를 이해하는 것입니다. 우리 그룹과 다른 연구진은 최근 확산 탈분극(dispolarization)이 쥐의 가벼운 폐쇄 두개골 부상에서 발생한다는 것을 보여주었다. 일반적으로 사용되는 생체 내 전기생리학 증폭기는 확산 탈분극과 관련된 느린 세포 외 이동을 필터링하여 확산 탈분극을 감지하는 것을 거의 불가능하게 만듭니다.

이 프로토콜의 장점은 이미징과 생체 내 전기생리학을 모두 활용하여 경미한 외상성 뇌 손상 후 확산되는 탈분극의 부재 또는 존재를 확인하는 것입니다. 우리는 MTBI와 관련된 급성 행동, 병리학 및 장기적인 인지 결핍에서 탈분극을 퍼뜨리는 역할을 이해하기 시작했습니다. 시작하려면 마취된 동물을 입체 프레임에 놓고 발열 패드를 사용하여 동물의 체온을 유지합니다.

숫자 10 메스 날을 사용하여 정중선을 따라 복부에서 꼬리까지 절개합니다. 그리고 즉시 절개 부위에 시아노아크릴레이트 접착제를 바르십시오. 그런 다음 피부를 옆으로 펴서 두개골을 노출시킵니다.

두개골에 시아노아크릴레이트 접착제를 한두 방울 더 떨어뜨려 두개골을 추가로 보호하십시오. 접착제가 마르는 동안 멸균 수술용 가위를 사용하여 소뇌 위의 절개 크기를 늘립니다. 그런 다음 0.8mm 드릴 비트를 사용하여 두개골에 파일럿 구멍을 뚫고 나사를 두개골에 끼웁니다.

여분의 와이어를 나사 주위에 감아 헤드 스테이지 나중에 배치할 때 약간의 여유를 허용합니다. 모든 두개골 나사가 제자리에 고정되면 모든 금색 핀을 원하는 헤드 스테이지 커넥터에 꽂습니다. 입체식 암으로 커넥터를 제자리에 잡고 와이어 접촉 없이 커넥터 핀을 나사 머리 위에 가깝게 배치합니다.

시아노아크릴레이트 접착제로 전체 영역을 밀봉하여 두개골 나사 앞의 이미징 영역이 방해받지 않도록 합니다. 금핀 바닥 주위에 치과용 시멘트를 바르고 두개골 나사의 금핀이 헤드 스테이지의 금핀과 연결되지 않도록 합니다. 헤드 스테이지 커넥터를 제거하기 전에 치과 시멘트가 경화되도록 하십시오.

시작하려면 IOS 컴퓨터와 LED 패널 보드를 켭니다. 전극을 이식한 마취된 동물을 카메라 아래의 임팩트 베드에 장착합니다. 그리고 피질 표면을 덮도록 초점 링을 조정합니다.

고유 광 신호 또는 IOS 설정을 로드한 후 라이브 버튼을 눌러 view 마우스를 보고 동물의 두개골을 카메라 아래 중앙에 놓습니다. 그런 다음 Multi-D Acquisition을 눌러 획득 설정에 액세스하고 원하는 시점을 선택합니다. 적절한 이름 접두사를 사용하여 지정된 파일 경로에 이미지를 저장합니다.

동물의 금색 핀을 헤드 스테이지 커넥터에 연결한 다음 헤드 스테이지에 연결합니다. 전기생리학 컴퓨터를 켜고 컴퓨터를 전기생리학 장비에 연결합니다. Intan 소프트웨어에 대한 설정을 로드한 후 파일 형식 선택 아이콘을 클릭하고 팝업 창에서 신호 유형 형식당 하나의 파일을 선택합니다.

그런 다음 하드웨어 대역폭의 BW 탭에서 0.13-500Hz의 증폭기 대역폭을 선택합니다. Filter Display Selector(필터 디스플레이 선택기)에서 Wide(와이드)를 선택합니다. 로우 및 하이 패스 필터를 설정한 후 파일 이름 선택 아이콘을 클릭하여 저장할 파일 경로를 선택합니다.

충격을 가하려면 전자기 임팩터를 켜고 레버를 튕겨 팁이 제대로 수축 및 확장되는지 확인하십시오. 동물을 거품 침대에 빠르게 놓고 침대를 임팩터 끝 아래로 밀어 넣습니다. 임팩터 팁을 정중선에 맞추고 브레그마 1mm 길이에 배치합니다.

그런 다음 임팩터 팁이 동물의 머리 꼭대기에 단단히 닿을 때까지 내립니다. 레버를 밀어 임팩터 팁을 집어넣은 다음 임팩트 레버를 활성화하기 전에 수동으로 5mm 낮추십시오. 즉시 폼 베드에서 동물을 꺼내 카메라 아래에 놓으면 5초 이내에 이미징할 수 있습니다.

Acquire를 클릭하여 Multi-Dimensional Acquisition 창에서 IOS 이미징을 시작합니다. 4분 동안 이미지를 캡처하여 전체 확산 탈분극 이벤트를 기록합니다. 전기생리학 기록을 시작하려면 Intan 소프트웨어에서 기록 아이콘을 클릭하십시오.

녹음이 완료되면 머리 스테이지와 커넥터에서 동물의 플러그를 뽑고 케이지에 다시 넣습니다. 이미지 스택을 열려면 File(파일)을 클릭한 다음 Import(가져오기) 및 Image Sequence(이미지 시퀀스)를 클릭합니다. 커서를 사용하여 관심 영역을 정의하는 사각형을 그려 확산 탈분극의 플롯을 생성합니다.

Image(이미지), Stacks(스택), Plot Z-axis Profile(Z축 프로파일)로 이동하여 그래프를 플롯하고 Live(라이브) 버튼을 클릭합니다. 생성된 플롯에서 List를 클릭하여 값 목록을 생성합니다. 시각화를 위해 화재 조회 테이블을 사용하여 회색조 이미지를 변환합니다.

확산되는 탈분극(depolarization)이 피질과 창문을 통해 큰 혈관을 가로질러 전파되는 것이 관찰되었습니다. 전기생리학 기록에서 고주파 활성은 이소플루란 제거 후 가짜 동물에서 빠른 회복을 보여주었습니다. 그러나 탈분극된 동물에서는 회복 전에 몇 분 동안 고주파 활동이 억제된 상태로 유지되었습니다.

파워 플롯은 두 조건 모두에서 억제에서 회복된 후 파워가 명확하게 상승하는 것을 보여주었습니다.