Name: 고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 쥐 안구 및 비안구 조직의 식이 비타민 A 대사 산물의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 학습하세요 HPLC를 사용하여 쥐 안구 및 비안구 조직의 비타민 A 대사 산물을 정량 분석하는 방법을. STRA6과 RBPR2 수송체의 생리학적 기능을 연구하여 시각 기능에 필수적인 레티노이드 프로파일을 생성합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>로돕신 기능 연구를 위한 쥐 조직의 비타민 A 대사 산물 분석

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Octanol, HPLC에 적합, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore 시그마</td><td>203-917-6</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxane, HPLC에 적합, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>204-661-8</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-retinal</td><td>National Eye Institute N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-레티놀</td><td>토론토 연구 화학 물질</td><td>TRC-R252105</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-레티날</td><td>토론토 연구 화학</td><td>TRC-R239900</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-레티놀</td><td>토론토 연구 화학</td><td>TRC-R252110</td><td></td></tr><tr><td>모든 트랜스-레티날</td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>TRC-R240000</td><td></td></tr><tr><td>모든 트랜스-레티놀</td><td>토론토 연구 화학물질</td><td>TRC-R252002</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이트, HPLC에 적합, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>205-500-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific, Spectrum Chemical</td><td>18-610-808</td><td></td></tr><tr><td>메탄올(HPLC)</td><td>Fisher Scienctific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>레티닐 팔미테이</td>트 <td>토론토 연구 화학 물질</td><td>TRC-R275450</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(결정질/인증 ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 분석 분획 수집기</td><td>Agilent</td><td>G1364F</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 이진 펌프</td><td>Agilent</td><td>G7112B</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 다이오드 어레이 검출기</td><td>Agilent</td><td>G7115A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 다중 컬럼 온도 조절기</td><td>Agilent</td><td>G7116A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 바이알샘플러</td><td>애질런트</td><td>G7129A</td><td></td></tr><tr><td>ST40R 냉장 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSST40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus 원심분리기</td><td>농축기 Eppendorf</td><td>22820168</td><td></td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL 호박색 스크류 탑 바이알</td> 애<td>질런트</td><td>5188-6535</td><td></td></tr><tr><td>PTFE/적색 고무 격막이 있는 크림프 캡, 11mm</td><td>Agilent</td><td>5183-4498</td><td></td></tr><tr><td>일회용 유리 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS9950215</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡 튜브, 15mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>바이알 인서트, 150 &마이크로; L, 폴리머 피트가 있는 유리</td><td>애질런트</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 쥐 안구 및 비안구 조직의 식이 비타민 a 대사 산물의 정량 분석

Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography

여기에서는 위에서 설명한 방법을 활용하여 쥐 안구 및 전신 조직에서 레티노이드를 검출 및 정량화하고 대표적인 크로마토그램을 생성했습니다. 또한 이러한 조직에서 검출될 수 있는 일반적인 레티노이드에 대한 요약을 제공할 것입니다.
생후 6개월이 되었을 때, 생쥐는CO2 질식을 통해 안락사시켰다. 안구 레티노이드 함량을 유지하기 위해, 마우스는 안락사 및 추출 전에 2일 동안 어두운 적응을 하였다. 레티노이드 추출 및 후속 HPLC 분석을 위해 두 개의 눈, 0.2g의 간, 75μL의 혈액을 채취했습니다. 안구 조직의 경우, 히드록실아민을 첨가하지 않고 한쪽 눈을 발치하고, 다른 쪽 눈은 히드록실아민 처리를 실시했습니다. 간과 혈액의 경우, 레틴알데히드는 일반적으로 이러한 조직에서 검출되지 않기 때문에 하이드록실아민 치료가 필요하지 않았습니다.
하이드록실아민으로 처리하지 않은 쥐 눈의 크로마토그램에서 두 개의 비표준 레틴알데히드 이성질체 중 하나인 13-시스-레티날이 확인되었습니다. 또한, 두 개의 표준 레틴알데히드 이성질체인 11-cis-retinal 및 all-trans-retinal이 모두 확인되었습니다. 두 크로마토그램 모두에서 시각 주기 중간체 11-시스-레티놀과 주요 비타민 A 수송 형태인 all-trans-레티놀을 모두 확인했습니다(그림 4A).
하이드록실아민으로 처리한 쥐 눈의 크로마토그램에서는 앞서 언급한 모든 레틴알데히드 이성질체가 여전히 존재했습니다. 그러나 이러한 이성질체의 머무름 시간은 크게 증가했습니다. 더욱이, 이러한 레틴알데히드 이성질체는 현재 syn 및 anti 이성질체로 존재합니다. peak integration을 통한 정량화 중에는 정확한 integration 값을 얻기 위해 syn 및 anti peaks를 모두 합산해야 합니다. 11-시스-레티놀과 올-트랜스-레티놀 모두 여전히 존재했다(그림 4B).
생쥐 간 조직의 크로마토그램에서 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate)와 올-트랜스-레티놀(all-trans-retinol)이 이들 조직 내에서 확인되었습니다. 레티닐 에스테르인 레티닐 팔미테이트는 포유류에서 비타민 A의 주요 저장 형태 역할을 하며 포유류의 간 조직에서 상당한 양으로 발견될 수 있습니다. 간은 비타민 A를 홀로-RBP4로 전신 조직으로 방출하며, 이 세포는 RBP4-트랜스트리에틴 복합체 내에 모든 트랜스-레티놀을 함유하고 있습니다. 그 후, 이 크로마토그램 내에서 큰 all-trans-retinol 피크를 식별할 수 있습니다(그림 4C).
생쥐 혈액의 크로마토그램에서 큰 all-trans-retinol 피크가 확인되었습니다. 간에서 홀로-RBP4가 순환계를 통해 전신 조직으로 방출된다는 점을 감안할 때 이는 예상된 결과입니다(그림 4D). 시간 종속 분해 HPLC 피크에서 레티노이드 동형의 특징적인 UV 스펙트럼 흡광도(~250-400nm)는 특정 각 피크에서 동형의 존재를 초기에 교차 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 (그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig01.jpg"> 그림 1: 레티노이드의 화학 구조. (A) 이러한 레티노이드는 일반적으로 추출된 쥐 조직에서 발견됩니다. 레티노이드 이성질체에서 cis 이중 결합의 위치가 다르고 극성 말단 그룹이 다르다는 점에 유의하십시오. (B) 레틴알데히드를 레티날 옥시메로 전환하면 추출 효율이 증가하고, 레티닐 팔미테이트와의 피크 동시 용출 및 레틴알데히드 이성질체 내 동시 용리를 방지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig02.jpg"> 그림 2: 조직 채취, 균질화, 레티노이드 추출 및 분석을 위한 워크플로우. 어둡게 적응된 마우스의 망막과 조직 샘플을 균질화하여 추출했습니다. 1 단계 : 지침에 따라 쥐를 안락사시킨 후 혈액과 다양한 조직을 채취합니다. 2-4단계: 그런 다음 식염수와 메탄올을 사용하여 조직 균질화를 수행하고 정량 분석을 위해 하이드록실아민 염산염을 사용합니다. 5-7단계: 레티노이드는 헥산을 사용하여 처리한 후 증발시킵니다. 8,9 단계 : 모든 레티노이드가 용해되도록 100μL의 헥산으로 재현탁합니다. 10 단계 : 마지막으로 HPLC를 사용하여 샘플을 분석합니다. 약어: HPLC = High-performance liquid chromatography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig03.jpg"> 그림 3: 레티노이드 표준물질과 하이드록실아민 처리된 레티노이드 표준물질의 크로마토그램. (A) 이 크로마토그램에는 레티닐 팔미테이트, 13-시스-레티날, 11-시스-레티날, all-trans-retinal, 11-시스-레티놀, 13-시스-레티놀 및 all-trans-레티놀 표준물질이 포함되어 있습니다. (B) 이 크로마토그램에는 레티닐 팔미테이트, 13-시스-레티날, 11-시스-레티널, 올-트랜스-레티널, 11-시스-레티놀, 13-시스-레티놀 및 올-트랜스-레티놀 표준물질이 포함되어 있습니다. 이 크로마토그램에는 레티놀 이성질체 외에도 syn 및 anti oxime 레틴알데히드 이성질체가 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig04.jpg"> 그림 4: 대표적인 크로마토그램. (A) 쥐 안구 조직의 대표 크로마토그램. 이 크로마토그램에는 레티놀 이성질체 외에도 레틴알데히드 이성질체를 포함하여 쥐 안구 조직에서 일반적으로 발견되는 레티노이드가 포함되어 있습니다. (B) 하이드록실아민 처리된 마우스 안구 조직의 대표 크로마토그램. 이전 크로마토그램(그림 4A)에서 발견된 화학적으로 변형되지 않은 레틴알데히드 대신, 이 크로마토그램에는 레티놀 이성질체 외에도 syn 및 anti oxime retinaldeyde 이성질체가 포함되어 있습니다. (C) 마우스 간 조직의 대표 크로마토그램. 이 크로마토그램에는 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate) 및 올-트랜스-레티놀(all-trans-retinol)을 포함하여 쥐 간 조직에서 일반적으로 발견되는 레티노이드가 포함되어 있습니다. (D) 쥐 혈액의 대표 크로마토그램. 이 크로마토그램에는 all-trans-retinol을 포함하여 쥐의 혈액에서 일반적으로 발견되는 레티노이드가 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig05.jpg"> 그림 5: 쥐 안구 조직에서 추출한 레틴알데히드 이성질체의 UV 흡광도 스펙트럼. (A) 13-시스-레티날, (B) 11-시스-레티날, (C) 9-시스-레티널, (D) 모든 트랜스-레티날, (E) syn 11-시스-레티날 옥심, (F) 안티 11-시스-레티날 옥심의 흡광도 스펙트럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig06.jpg"> 그림 6: HPLC 모듈, 이동상 흐름 및 기타 기기의 개요. 이동상 흐름은 준비된 용매 병에서 시작하여 2액(binary) 펌프에 의해 고압으로 자동 시료 주입기로 펌핑되며, 여기서 분석물질은 용매 흐름에 통합됩니다. 이동상과 분석물질은 온도 조절이 가능한 컬럼 컴파트먼트에 도달하고, 최종적으로 측정을 위해 다이오드 어레이 검출기로 들어갑니다. (A) 레티노이드의 광이성질체화를 최소화하는 빨간색 모니터 화면. (B) 바이너리 펌프. (C) 바이알 샘플러. (D) 다중 열 온도 조절기. (E) 다이오드 어레이 검출기. (F) 분석 분획 분취기. (G) 고밀도 폴리 폐기물 용기. (H) 왼쪽에서 오른쪽으로, 알루미늄 크림프 캡, 폴리머 피트가 있는 250μL 인서트, 황색 크림프 상단 바이알, 주입 바이알의 최종 조립품. (I) 왼쪽, 냉장 원심분리기. 오른쪽, 원심분리기 농축기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>화합물</td>
			<td>몰 흡수율 (ε)</td>
			<td>용매</td>
			<td>참조</td>
		</tr><tr><td>레티닐 팔미테이트</td>
			<td>49260</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr><tr><td>13-시스-망막</td>
			<td>35500</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr><tr><td>11-시스-망막</td>
			<td>24935</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr><tr><td>9-시스-망막</td>
			<td>36100</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>Robeson 외 51</td>
		</tr><tr><td>모든 트랜스 망막</td>
			<td>42880</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr><tr><td>11-시스-레티놀</td>
			<td>34890</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr><tr><td>13-시스-레티놀</td>
			<td>48305</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>Robeson 외 50 및 Robeson 외 51</td>
		</tr><tr><td>올-트랜스-레티놀</td>
			<td>52770</td>
			<td>에탄올</td>
			<td>허버드 외.49</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 에탄올에서 레티노이드의 몰 흡수율. 레티노이드의 몰 흡수율 값은 Kane 및 Napoli44, Hubbard et al.46, Robeson et al.47 및 Robeson et al.48로부터 수집하였다. 몰 흡수율은 용매에 따라 다릅니다. 여기에 나열된 값은 에탄올에 용해된 레티노이드에만 해당됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>조직</td>
			<td>조직 수확량</td>
			<td>균질화를 위한 부피</td>
		</tr><tr><td>피</td>
			<td>75 마이크로리터</td>
			<td>해당 없음</td>
		</tr><tr><td>간</td>
			<td>0.2 지</td>
			<td>2mL</td>
		</tr><tr><td>신장</td>
			<td>2 전체 신장</td>
			<td>2mL</td>
		</tr><tr><td>피부</td>
			<td>0.2 지</td>
			<td>1mL – 1.5mL</td>
		</tr><tr><td>지라</td>
			<td>1 전체 비장</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>눈</td>
			<td>양쪽 레티나, 풀 4 레티나</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>뇌</td>
			<td>1 전뇌</td>
			<td>2mL</td>
		</tr><tr><td>심장</td>
			<td>1 진심</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>부아</td>
			<td>0.2 지</td>
			<td>2mL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 분석당 권장되는 조직 양. Kane 및 Napoli44에서 권장하는 조직 균질화를 위한 50% 얼음-냉 식염수(0.9%) 및 50% 메탄올의 분석당 조직 양 및 부피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>화합물</td>
			<td>머무름 시간(분)</td>
			<td>UV 흡광도 최대값 (nm)</td>
		</tr><tr><td>레티닐 팔미테이트</td>
			<td>5.177</td>
			<td>326</td>
		</tr><tr><td>13-시스-망막</td>
			<td>7.268</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>11-시스-망막</td>
			<td>7.691</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>9-시스-망막</td>
			<td>7.931</td>
			<td>364</td>
		</tr><tr><td>모든 트랜스 망막</td>
			<td>8.993</td>
			<td>370</td>
		</tr><tr><td>11-시스-레티놀</td>
			<td>17.003</td>
			<td>318</td>
		</tr><tr><td>13-시스-레티놀</td>
			<td>17.83</td>
			<td>328</td>
		</tr><tr><td>올-트랜스-레티놀</td>
			<td>23.933</td>
			<td>326</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 레티노이드의 머무름 시간 및 최대 흡광도 파장. 이 값들은 참조된 다이오드 어레이 검출기로 검출된 바와 같이 설명된 방법 및 이동상과 함께 사용될 때 관찰되었습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>화합물</td>
			<td>머무름 시간(분)</td>
			<td>UV 흡광도 최대값 (nm)</td>
		</tr><tr><td>Syn 11-cis-망막 산소 농도</td>
			<td>9.59</td>
			<td>346</td>
		</tr><tr><td>신(Syn )모든 트랜스 망막 산소 농도</td>
			<td>10.6</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Syn 13-cis-망막 옥심</td>
			<td>11.3</td>
			<td>352</td>
		</tr><tr><td>안티 13-시스-망막 산소 농도</td>
			<td>13</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>안티 11-시스-망막 산소</td>
			<td>15.1</td>
			<td>350</td>
		</tr><tr><td>반 모든 트랜스 망막 산소 농도</td>
			<td>19.7</td>
			<td>360</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 하이드록실아민 처리된 레틴알데히드의 머무름 시간 및 최대 흡광도 파장, 각 레틴알데히드의 syn 및 anti oxime 이성질체. 이 값들은 참조된 다이오드 어레이 검출기로 검출된 바와 같이 설명된 방법 및 이동상과 함께 사용될 때 관찰되었습니다.

고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 쥐 안구 및 비안구 조직의 식이 비타민 A 대사 산물의 정량 분석

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