Name: 고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 Resipher 장치를 이용한 망막 색소 상피 산소 소비율 장기 측정법을. 고도로 분화된 RPE 배양에서 수 주간의 생체에너지 프로파일링이 가능하며, 이상적인 배양 조건 하에서 세포 건강을 유지하면서 미토콘드리아 기능을 평가합니다.

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우리는 대조군으로 새로운 매체와 조건화된 매체에서 O2 용해도를 테스트하는 아이디어에 대해 Daniel Hass 박사와 Jim Hurley 박사에게 감사드립니다. 원고에 대한 편집에 도움을 주신 Magali Saint-Geniez 박사님께 감사드립니다. Resipher USB 케이블로 저산소증 챔버를 개조해 준 Kellogg Eye Center의 Instrument and Electronic Services Core의 Scott Szalay에게 감사드립니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. Electronic Services Core는 National Eye Institute의 P30 EY007003 의해 지원됩니다. 이 연구는 Research to Prevent Blindness(RPB)의 무제한 부서 보조금으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 건성 연령 관련 황반변성을 위한 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration), E. 마틸다 지글러 시각 장애인 재단(E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind), 에버사이트 안구 은행 보조금, 국립 안과 연구소(National Eye Institute)의 K08EY033420 보조금, 디 앤 딕슨 브라운(Dee and Dickson Brown), 데이비드 앤 리사 드류스 디스커버링 호프 재단(David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation)의 지원을 받고 있습니다. D.Y.S.는 UNSW 사이언티아 프로그램(UNSW Scientia Program)의 지원을 받습니다. L.A.K.는 Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, National Eye Institute의 R01EY027739 보조금 및 국방부 육군 의료 연구 획득 활동 VR220059의 지원을 받습니다.

차별화된 RPE 배양을 위한 새로운 OCR 모니터링 시스템

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

리처드 A. 브라이언(Richard A. Bryan)과 킨 로(Kin Lo)는 리시퍼 시스템을 제조하는 루시드 사이언티픽(Lucid Scientific)의 직원이다.

RPE의 미토콘드리아 대사는 AMD 및 PVR을 포함한 일반적인 실명 망막 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. RPE 미토콘드리아 대사 를 체외에서 모델링하면 신진대사 상태를 주변 조직의 신진대사 상태와 분리할 수 있을 뿐만 아니라 조직을 통제된 방식으로 다양한 질병 시뮬레이션 모욕에 노출시킬 수 있습니다. 이러한 RPE 미토콘드리아 대사의 in vitro 모델링은 in vivo에서 RPE를 밀접하게 근사화하는 데 필요한 적절한 분화 상태 및 극성을 달성하는 고충실도 인간 1차 및 iPSC-RPE 배양의 출현에 의해 촉진되었습니다. 이러한 배양에서 산소 소비율(OCR)을 모니터링하는 것은 미토콘드리아 대사를 모니터링하는 이상적인 방법이지만, OCR 모니터링 설정은 종종 고도로 분극화되고 완전히 분화된 RPE에 필요한 조건에서 배양을 성장시키지 못합니다. 여기에서는 Resipher를 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양에서 OCR의 실시간 장기 평가를 통해 RPE 미토콘드리아 대사를 모니터링하기 위한 새로운 시스템으로 설명합니다.
RPE에서 OCR을 모니터링하기 위해 다른 방법이 사용되었습니다. Seahorse XF 분석기는 미토콘드리아 기능의 급성 조작을 통해 단기간에 OCR을 모니터링하도록 설계되었습니다. 그러나 Seahorse 분석은 세포를 맞춤형 플레이트에서 성장시켜야 하며, 이는 높은 RPE 극성 및 분화를 지원하는 데 도움이 되지 않습니다21. Calton, Vollrath 및 동료들은 미세 다공성 멤브레인을 조각으로 자르고 Seahorse 플레이트에 넣어 미세 다공성 지지체에서 성장한 고도로 분화된 RPE 배양을 평가하기 위해 Seahorse를 조정했지만, 이 방법은 세포가 CO2 에 접근할 수 없기 때문에 배양의 단기 종료점 모니터링에만 여전히 효과적입니다 분석 중에, 분석은 비멸균 조건에서만 수행될 수 있으며, 미세 다공성 지지체를 절단하면 시간이 지남에 따라 미세 다공성 지지체의 가장자리 부분에 사멸 및 기능 장애가 유발됩니다22. Barofuse는 미세 다공성 지지체에서 성장한 RPE 스트립을 관류 시스템에 로드할 수 있는 펌프가 없는 관류 시스템으로, OCR을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다23. Calton, Vollrath 및 동료들이 Seahorse에 대해 수정한 설정과 유사하게, Barofuse를 사용한 RPE 평가의 주요 한계는 미세 다공성 지지체를 절단해야 한다는 점과 분석의 단기적인 종점 특성입니다. Oxygraph는 또한 대사 조작에 대한 반응으로 OCR의 빠른 운동 변화를 위해 설계되었습니다24. 그것은 RPE 문화에는 사용되지 않았으며 Seahorse 및 Barofuse와 같이 매우 양극화되고 차별화 된 RPE 문화를 평가하는 데 동일한 제한을 겪을 것입니다.
이러한 다른 방법과 달리, 여기에 설명된 OCR 시스템을 사용하면 RPE가 표준 세포 배양 CO2 인큐베이터에서 표준 RPE 배지를 사용하여 표준 조건의 표준 세포 배양 플레이트/기질에서 배양되는 동안 OCR을 모니터링할 수 있으므로 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양을 쉽고 편리하게 프로빙할 수 있습니다. 시스템에 의한 실시간 OCR 변경에 대한 데이터를 생성하는 것 외에도 OCR 모니터링 기간이 끝날 때 동일한 셀을 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 OCR에 대한 중재의 효과를 몇 주에 걸쳐 반복적으로 테스트하거나(예: 그림 5의 RPE EMT 유도) 중재의 장기 회복을 테스트할 수 있거나(예: 그림 3의 미토콘드리아 분리로부터의 회복) 초기 중재에 대한 반응으로 계단식 대사 변화를 모니터링할 수 있는 매우 유연한 실험을 수행할 수 있습니다(예: 그림 - 배지 영양소가 고갈된 후 OCR에 대한 혈청의 효과) 2). 이 논문의 OCR 시스템은 고도로 분극화되고 분화된 RPE 문화에서 OCR을 측정하는 데 특히 편리합니다. 이러한 배양은 기능적으로 분열 후(postmitotic)이며, 꽉 조여져 있고 색소 침착이 심합니다. 이는 각 웰이 거의 동일한 세포 번호9를 포함하고 있음을 의미하며, 따라서 대부분의 실험에서 OCR을 세포 수로 정규화할 필요가 없습니다. 세포 수에 대한 정규화가 필요한 경우에도 RPE 색소 침착이 심하고 세포 경계가 잘 구분되어 있어 명시야 이미징을 기반으로 하는 비침습적 단순 세포 수로 정규화가 가능합니다. 그림 5의 EMT 실험과 같이 미분화 RPE 및 RPE 증식과 관련된 실험의 경우, "세포당" OCR이 무엇인지 알기 위해 웰당 OCR을 세포 수로 정규화하는 것이 필요합니다.
망막 분야 밖에서, 이 시스템은 췌장 섬 세포(pancreatic islet cells)25, 골격근(skeletal muscle)26, 난소암(ovarian cancer)27, 심근세포(cardiomyocytes)28, 심지어 예쁜꼬마선충(C. elegans) 29과 같은 전체 유기체를 포함한 다양한 세포 유형에서 세포 호흡 및 대사 활동을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 여기에 설명된 OCR 시스템을 사용한 OCR의 실시간 장기 모니터링은 이러한 다양한 질병 모델에서 생체 에너지 변화 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 주요 통찰력을 보여주었습니다.
Resipher 시스템에는 제한 사항이 있습니다. OCR을 결정하는 방법은 Seahorse Analyzer, BaroFuse 또는 Oxygraph와 근본적으로 다릅니다. OCR을 계산하기 위해 O2 그래디언트를 설정해야 하며 그래디언트를 설정하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 따라서 다른 시스템에서는 가능한 빠른 역학 실험이 이 시스템에서는 불가능합니다. 또한 다른 시스템과 달리 Resipher에는 소분자의 빠른 전달 또는 대사 산물 수집을 위한 주입 포트가 없습니다. 대신, 세포 배양 후드에서 감지 뚜껑을 제거하고, 약물을 주입하거나 배지를 교체하고, 분석할 대사 산물을 수동으로 수집해야 합니다.
이 문서에 설명된 OCR 시스템을 사용하여 실험을 설정하고 문제를 해결하려면 다음을 수행하는 것이 좋습니다. 첫째, 증발을 최소화합니다. RPE 단층 위의 매체 열에 있는O2 그래디언트는 컬럼9의 높이에 크게 의존하며 시스템은O2 그래디언트를 기반으로 OCR을 계산합니다. 따라서 증발로 인해 실험 중에 매체 컬럼이 현저하게 낮아지면O2 그래디언트가 변경되어 OCR 판독값에 영향을 미칩니다. 인큐베이터의 물 트레이를 가득 채우는 것이 중요하지만 96웰 플레이트의 사용하지 않는 모든 웰에 물을 넣는 것도 좋습니다. 또한, 플레이트 가장자리에 있는 웰은 증발 속도가 더 높기 때문에 위에 제시된 일반적인 실험에서 이러한 웰에는 세포가 비어 있습니다. OCR 시스템의 습도 센서는 인큐베이터 습도를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그림 8A에서 실험 중 습도 강하는 인큐베이터의 물 트레이가 비어 있음을 시사합니다. 우물에서 증발이 가속화됨에 따라 우물의 O2 농도 판독 값은 더 높아지고 결국 대기 O2 농도 (~ 200 μM)에서 "평탄선"이 될 것입니다 (그림 8A).
둘째, OCR 시스템의 "샌드위치"가 적절하게 조립되었는지 확인합니다. 장치 하단과 감지 덮개 상단의 금속 접촉 지점은 완전한 접촉을 방해하는 이물질이 없이 깨끗해야 합니다. 장치와 감지 덮개는 완전히 같은 높이로 부착되어야 하며 기울어지지 않고 96웰 플레이트에 균일하게 정렬되어야 합니다. 장치를 허브에 연결하는 USB 케이블은 장력이 가해져 있지 않아야 하며, 이로 인해 "샌드위치"의 토크가 발생하고 장치의 적절한 움직임이 제한될 수 있습니다.
셋째, 장치와 감지 덮개 센서가 보정되었는지 확인합니다. 그림 2B 는 각 실험을 시작할 때 적절한 센서 기능을 빠르게 확인하는 방법을 자세히 보여줍니다. 넷째, 실험적 조작 전에 특정 웰이 이상치 OCR을 나타내지 않는지 확인합니다. 센서가 작동하는지 확인한 후 세포가 있는 모든 웰에 대한 기준선 OCR 값을 결정하면 특정 웰에 비정상 세포가 포함되어 있는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그림 8B 는 기준선 OCR 평가를 받는 여러 웰을 보여주며, 여기서 파란색 웰은 분명히 더 낮은 OCR(따라서 높은O2 농도)을 보여줍니다. 이 웰은 이상치이며 실험적 조작에서 제외해야 합니다.
다섯째, 활성 OCR 판독 중 환경 조작을 최소화합니다. O2 그래디언트는 온도, 습도, 인큐베이터 CO2 수준 및 대기압의 변화에 매우 민감합니다. 인큐베이터 도어 개방은 이러한 요인에 큰 영향을 미치며, 배지 컬럼의 O2 그래디언트가 평형으로 돌아올 때까지 OCR 판독에 일시적인 중단을 일으킵니다(그림 8C). OCR에 영향을 미치는 매개변수는 "환경" 탭 아래의 시스템 온라인 인터페이스에서 모니터링할 수 있습니다(그림 8A).
여섯째, 실험에 가장 적합한 미디어 볼륨을 결정합니다. 매체 부피가 충분하지 않으면 과도한 증발(위의 첫 번째 문제 해결 방법 참조) 또는 매체 내 영양소의 조기 고갈로 인한 아티팩트가 생성될 수 있지만, 과도한 매체 부피는 RPE 단층에 대한 O2 가용성을 제한하여 저산소증9를 유발합니다. 도 7 은 RPE 단층에서O2 농도에 대한 매체 부피의 효과를 결정하는 데 사용할 수 있는 온라인 계산기의 스크린샷이다. 주어진 미디어 볼륨에 대해 가능한 최대 OCR은 그림 9A에 표시되어 있습니다. 주어진 부피를 사용하는 주어진 실험에 대한 OCR 속도가 그림 9A에 표시된 속도와 비슷하면 RPE 단층에서의O2 농도가 산소 결핍(0%)에 가까워지고 더 낮은 매체 부피가 필요합니다. 일반적으로 RPE 배양에서 미토콘드리아 집약적 공정과 관련된 실험은 96-웰당 75μL를 넘지 않아야 합니다.
일곱째, OCR에 대한 실험적 개입의 효과를 분리하기 위해 적절한 정규화를 수행합니다. 서로 다른 웰은 서로 다른 기준선 OCR을 가질 수 있으므로 실험적 개입 전에 각 웰에 대한 기준선 OCR 판독값을 얻는 것이 중요합니다. OCR에 대한 실험적 개입의 효과를 보여주는 "델타 OCR"을 얻기 위해 실험적 개입 후 OCR에서 기준선 OCR을 뺍니다. "델타 OCR"을 얻는 방법은 그림 3 및 그림 9B에 설명되어 있습니다. OCR을 유도하는 다른 실험적 중재의 능력에 대한 한 실험적 중재의 효과에 관심이 있는 경우, 추가적인 정규화 단계인 "델타-델타 OCR"이 필요합니다. 이러한 예는 그림 9B에 나타나 있으며, 여기서 팔미테이트(1회 실험적 중재)가 OCR을 증가(β산화 유도를 통해)를 유도하는 능력은 RPE 배양(2차 실험적 중재)을 위한 배지 유형에 따라 달라집니다.
마지막으로, 오염 위험을 최소화하십시오. 이 시스템은 세포 위의 매체에 산소 센서를 도입하여 OCR을 모니터링합니다. 이것은 감염의 위험을 증가시킵니다. 실험 중 OCR이 예기치 않게 떨어지거나 실험 시작 시 예기치 않게 낮은 OCR은 감염의 징후일 수 있습니다. 세포 배양 현미경으로 플레이트의 감염 여부를 적극적으로 모니터링해야 합니다. 96웰 플레이트 간의 교차 오염은 감지 덮개를 재사용하는 경우 발생할 수 있습니다. 이러한 교차 오염을 최소화하려면 실험이 완료된 후 오염 제거를 위해 뚜껑 전체를 70% 에탄올에 20분 동안 담가야 하며, 새 실험에서 감지 뚜껑을 재사용해야 합니다(프로토콜 섹션 1.2.15 참조).
결론적으로, Resipher라는 새로운 시스템을 사용하여 OCR 평가를 통해 고충실도 RPE 배양에서 미토콘드리아 대사를 실시간으로 장기간 모니터링하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 제품은 고도로 분극화되고 분화된 RPE 배양에 대한 수많은 응용 분야에 사용될 수 있으며, 특히 AMD 및 PVR을 포함한 망막 질환의 체외 모델에서 분리된 RPE의 생리학적 대사 특성과 변형된 RPE 대사 특성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

망막 색소 상피(RPE)는 기능적으로 분열 후 고도로 분극된 상피 세포의 단층으로, 망막의 빛에 민감한 광수용체와 혈액 순환 사이에 장벽을 형성하며, 융모혈관이라고 하는 모세혈관층입니다. 신경교세포를 지원하는 뉴런의 역할과 마찬가지로, RPE는 광수용체 외부 분절의 식세포작용, 영양소 수송 및 광수용체의 대사 지원, 필수 성장 인자의 분비 등 광수용체를 지원하기 위한 수많은 기능을 수행하며, 이 모든 기능은 시각 기능 유지에 매우 중요합니다.
RPE의 퇴행은 몇 가지 일반적인 퇴행성 시력 장애의 기초가 됩니다. 전 세계에서 불치의 시력 상실의 가장 흔한 원인 중 하나인 연령 관련 황반 변성(AMD)의 경우 RPE가 죽고 이에 따라 상부에 있는 광수용체가 2차 변성을 겪습니다. 증식성 유리체병증(PVR)에서 RPE는 일반적으로 정지된 유사분열 후 상태를 벗어나 신진대사의 변화와 함께 중간엽 상태(소위 상피에서 중간엽으로의 전환[EMT])로 증식 및 역분화됩니다. RPE 역분화는 광수용체에 대한 RPE 지지의 손실을 유발하는 동시에 더 많은 섬유화 상태를 유발합니다. 그 결과 광수용체 변성과 RPE에 의한 흉터가 발생하며, 둘 다 시력 상실을 유발합니다 1,2.
광수용체에 대한 RPE의 지원 중 주요 부분은 대사이며, 대사 조절 장애는 AMD 및 PVR을 포함한 수많은 망막 질환에서 중요한 요소입니다. RPE는 광수용체와 광수용체의 산소 및 영양소 공급원인 융모모혈관 사이의 조절 장벽 역할을 합니다. 따라서 RPE가 대사를 위해 선택하는 것과 RPE가 융모막에서 광수용체로 통과하기로 선택하는 것은 광수용체 대사와 생존에 큰 영향을 미칩니다. 수많은 연구에 따르면 RPE는 정상적인 건강을 위해 미토콘드리아 대사에 크게 의존하며, 대신 광수용체는 해당작용에 크게 의존한다고 합니다3. 이것은 광수용체와 RPE 사이의 상보적이고 얽힌 대사 상태의 개념을 도입했습니다. 구체적으로, RPE는 선호하는 광수용체 대사 기질의 대사를 감소시키고, 대신 광수용체가 소비하지 않는 대사 산물과 결합된 광수용체 대사의 부산물을 이용합니다. PVR 및 AMD와 같은 질병에서 RPE가 해당작용이 더 커지고 미토콘드리아 대사에 덜 의존하게 된다는 증거가 강력하게 시사합니다. RPE 해당과정으로의 이러한 변화는 필요한 대사 산물의 광수용체를 굶주리게 하여 퇴행을 유발할 수 있습니다 4,5,6. RPE와 광수용체 대사가 얼마나 상호 의존적인지, 그리고 얼마나 많은 변화된 신진대사가 망막 질환의 기저에 있는지를 감안할 때, 치료 목적으로 RPE 대사를 모델링하고 조작하는 것에 대한 관심이 높습니다.
in vivo RPE 미토콘드리아 대사를 연구하는 것이 이상적이지만, RPE 미토콘드리아 대사의 많은 측면은 in vitro 배양 시스템에서만 실질적으로 조사할 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 충실도가 높은 RPE 배양에 대한 상당한 진전이 이루어졌으며, 현재 가장 신중하게 손질된 RPE 배양이 인간 임상시험에서 세포 대체 요법에 사용되고 있다7. 이러한 고충실도 배양을 유지하기 위해서는 실험 전 몇 달 동안 특정 배지의 특정 기질에서 RPE를 성장시켜야 합니다. 이러한 조건에서 RPE 배양은 최대로 분화되고 분극화되어 in vivo RPE에 근접합니다. 불행히도, 현재 생체 내 RPE에서 미토콘드리아 대사를 특이적으로 측정할 수 있는 장비는 없습니다. 망막 모세관 네트워크의 산소 모니터링은 전자 상자성 공명(EPR) 산소 측정법8을 사용하여 생체 내에서 이루어졌지만, RPE 분석에서는 불가능합니다. in vivo 및 in vitro의 RPE 대사 간의 차이는 잘 설명되지 않았지만 RPE 배양은 RPE in vivo 3,9와 유사한 높은 미토콘드리아 활성을 보이는 것으로 나타났으며, 이는 고충실도 RPE 배양을 사용하여 RPE 미토콘드리아 대사에 대한 상당한 통찰력을 얻을 수 있음을 시사합니다.
모든 미토콘드리아 대사가 산소 소비로 이어지기 때문에 RPE 산소 소비량(OCR)을 측정하는 것은 미토콘드리아 대사에 대한 충실한 대리물입니다. RPE 배양에서 OCR을 측정하는 것은 어려웠는데, 이는 최대 RPE 분극 및 분화를 촉진하는 조건으로 인해 Seahorse 분석기와 같은 현재 사용 가능한 기술을 사용하여 장기적으로 정확한 OCR 측정을 불가능하게 하는 경우가 많기 때문입니다. 이 방법 논문에서는 Resipher(이하 "시스템"이라고 함)라고 하는 새로운 장치를 소개하며, 이를 통해 편광 및 분화를 최대한 촉진하는 조건에서 성장한 RPE에서 몇 주에 걸쳐 OCR을 지속적으로 측정할 수 있습니다. RPE 분화 및 분극화를 최대한 촉진하는 RPE 배양 조건에서 이 시스템으로 OCR을 쉽게 측정할 수 있는 것은 기존 OCR 측정 장치 중에서도 유일합니다.
이 문서에서는 RPE 문화권에서 시스템을 사용하기 위한 팁과 요령을 제공하고 두 가지 특정 응용 프로그램에 대한 데모를 제공합니다. 첫째, PVR을 모방한 RPE EMT는 변형성장 인자-베타(TGFβ)1,10,11,12에 노출됨으로써 유발됩니다. 이 시스템은 EMT 과정에서 RPE 대사가 어떻게 변화하는지 모니터링하는 데 사용됩니다. 둘째, RPE 대사에서 저산소증의 역할은 이 시스템을 사용하여 탐구됩니다. 저산소증은 AMD의 발병에 중요한 기여를 하는데, 이는13,14세가 되면 맥락막모세혈관이 얇아지기 때문입니다. 이 시스템을 저산소증 챔버와 결합하면 노화에 수반되는 미묘한 저산소증과 함께 변화된 RPE 미토콘드리아 대사를 모델링할 수 있습니다. 마지막으로, Resipher 데이터를 사용하는 온라인 계산기를 도입하여 RPE 배양이 저산소, 정상 산소 또는 고산소 상태에 있는지 확인할 수 있습니다. 이러한 정보는 체외 RPE 배양 연구에서 RPE 대사에 대한 결론을 도출하는 데 매우 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32채널 Resipher 뚜껑</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A for Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>전자 전달 사슬의 복합체 III 억제제</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>미토콘드리아 호흡 증가를 위한 분리제</td></tr><tr><td>DMSO, 세포 배양 등급</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>미토콘드리아 약물 재구성을 위한 차량</td></tr><tr><td>세포외 매트릭스 코팅 기판: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>hfRPE용 세포외 매트릭스</td></tr><tr><td>세포 외 매트릭스 코팅 기질: Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>시그마</td><td>C2920-10MG</td>용 세포외 매트릭스 <td>미토콘드리아 호흡 증가를 위한 분리제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Bio-Techne S11550H)</td><td>바이오 테크네</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손-사이클로덱스트린</td><td>시그마</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>저산소증 챔버</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 매체 보충제</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 용액</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O2 센서</td><td>감작 기술 또는 법의학 검출기</td><td>P100 또는 FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF&베타; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>상피-중간엽 전이를 유도하기 위한 형질전환 성장 인자 베타-2</td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마</td><td>R8875-1G</td><td>전자수송계의 복합체 I 억제제</td></tr><tr><td>시스템 호환 플레이트</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Alpha Modification of Eagle's Media)</td><td>코닝</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

미토콘드리아 대사는 광수용체 생존에 중요한 망막 세포의 단층인 망막 색소 상피(RPE)의 정상적인 기능에 매우 중요합니다. RPE 미토콘드리아 기능 장애는 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반 변성(AMD)과 망막 박리의 실명 합병증인 증식성 유리체 변성증(PVR)의 특징입니다. RPE 퇴행성 질환은 in vivo RPE를 모방하기 위해 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양 시스템에 의해 잘 모델링되었습니다. 그러나 미토콘드리아 기능의 대리물인 산소 소비율(OCR)을 모니터링하는 것은 이상적인 RPE 분극 및 분화를 촉진하는 조건으로 인해 OCR 측정이 쉽지 않기 때문에 이러한 배양 시스템에서는 어려웠습니다. 
여기에서는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 최적의 성장 기질 및 생리학적 배양 배지에서 RPE를 유지하면서 잘 분화된 RPE 배양에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 모니터링하는 새로운 시스템인 Resipher를 소개합니다. 이 시스템은 세포 위의 매체에 존재하는 산소 농도 구배를 측정하여 OCR을 계산합니다. OCR을 감지하는 다른 방법에 비해 이 시스템의 장점과 RPE 문화권에서 OCR을 측정하기 위한 시스템을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 시스템 사용에 대한 주요 팁과 요령, 데이터 해석에 대한 주의, 예기치 않은 결과를 해결하기 위한 지침을 다룹니다. 
또한 시스템에서 감지한 세포 위의 배지 내 산소 구배를 기반으로 저산소증, 정상산소증 또는 고산소증 RPE 배양 경험을 추정할 수 있는 온라인 계산기를 제공합니다. 마지막으로, PVR 모델에서 RPE 세포의 대사 상태를 측정하고 RPE가 저산소증에 대사적으로 적응하는 방법을 이해하는 시스템의 두 가지 응용 프로그램을 검토합니다. 우리는 고도로 분극화되고 분화된 RPE 배양에 이 시스템을 사용하면 생리학적 및 질병 상태 모두에서 RPE 미토콘드리아 대사에 대한 이해를 높일 수 있을 것으로 기대합니다.

망막 색소 상피(RPE) 배양에서 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 새로운 장치를 소개합니다. 이 장치는 플레이트가 표준 세포 배양 인큐베이터에 있는 동안 표준 배지가 있는 표준 세포 배양 플레이트에서 성장한 RPE에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 측정할 수 있습니다.

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

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인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

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이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

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망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

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고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링

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