냄새 기둥을 탐색하는 생쥐의 해마에서 칼슘 신호를 기록하는 미니스코프

제 연구는 뇌가 후각 및 공간 정보를 어떻게 처리하는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 그리고 우리는 냄새-기둥 탐색에서 해마 CA1 뉴런의 역할을 이해하려고 노력하고 있습니다. 현재 소형 현미경으로 뉴런을 자유롭게 움직이는 기록 기술은 이 분야의 연구를 발전시키는 데 사용되어 왔습니다.

우리는 등쪽 CA1의 뉴런과 칼슘 신호를 기반으로 냄새 기둥을 탐색하는 쥐의 궤적을 해독할 수 있음을 발견했습니다. 이 기술은 GCaMP 칼슘 신호를 기록하기 위한 미니 스코프 기술의 장점과 잘 정립된 CA1 해마 공간 탐색 행을 결합합니다. 신경 회로가 어떻게 복잡한 행동을 유도하는지 더 잘 이해하기 위해, 비정상적인 CA1 해마 기능을 가진 알츠하이머병의 마우스 모델에서 냄새-기둥 탐색이 어떻게 손상되는지 조사할 것입니다.

시작하려면 두 개의 아크릴 벽과 아크릴 천장, 넓게 확장된 폴리염화비닐 바닥이 있는 챔버를 건설합니다. 전면과 후면에 있는 다른 두 개의 고유한 벽은 공기 흐름을 용이하게 해야 합니다. X축을 따라 10cm 떨어진 곳에 물 배출구와 쌍을 이루는 4세트의 냄새 소스를 배치합니다.

경기장 위에 고속 디지털 카메라를 설치하여 동물의 행동을 모니터링하십시오. 사용자 정의 Python 코드를 사용하여 냄새 경기장 하드웨어를 관리하고 소프트웨어는 실험 설정을 위해 카메라와 모든 하드웨어를 통합합니다. 미니 스코프와의 사후 동기화를 위해 비디오 프레임을 녹화할 때 클럭 신호를 내보내도록 디지털 카메라를 설정합니다.

빠른 응답 소형 광이온화 검출기(PID)를 악취원 가까이에 배치하고 다른 PID(Detect Detector)를 10cm 더 멀리 배치합니다. PID 컨트롤러의 전면 패널에 있는 게인 스위치를 X 5 위치로 변경합니다. 그런 다음 PID 컨트롤러의 전면 패널에 있는 펌프 스위치를 높은 위치로 변경합니다.

컨트롤러의 전면 패널에 있는 발광 다이오드 또는 LED 상태 표시등을 확인하여 센서 출력이 0 볼륨을 표시하는지 확인하십시오.tage 냄새 물질이 없을 때. 전위차계 오프셋을 0으로 전환하고 냄새 물질이 없을 때 전압 출력을 높이고 냄새 경기장에서 냄새 밸브를 켭니다. 밸브를 연 후 각 위치에서 PID로 악취 기둥을 감지하는 지연을 측정합니다.

시작하려면 실험을 위해 챔버, 카메라 및 광이온화 검출기 또는 PID 센서를 설정합니다. 마우스를 훈련시키려면 경기장 뒤쪽으로 이동하라는 메시지를 표시하십시오. 마우스가 뒤쪽에 도달한 후 무작위 레인으로 수동으로 냄새와 물을 전달하고 마우스가 소스를 찾아 물을 마시도록 합니다.

마우스가 시험을 시작하는 방법을 배우면 냄새 전달을 위해 자동화된 소프트웨어로 전환합니다. 2차선 냄새 탐색 작업에서 냄새를 전달할 두 개의 냄새 포트 중 하나를 무작위로 선택합니다. 그리고 마우스가 올바른 물 스파우트 헤드에 도달하면 물을 보상하고 마우스를 고정하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 베이스 플레이트 위에 미니 스코프를 놓습니다.

고정 나사를 조여 미니 스코프를 고정합니다. 최적의 초점면을 찾기 위해 electrowetting lens를 조정하여 가장 높은 형광 강도를 가진 가장 많은 수의 세포를 확보하십시오. 최적의 다이내믹 레인지를 얻으려면 등쪽 CA1을 사용하고 GCaMP 6-F 마우스 한 개를 묶어 30헤르츠 획득 속도에서 미니 스코프 출력을 약 30%로 설정합니다.

베이스 플레이트에 부착된 미니 스코프를 사용하여 냄새 경기장 내부로 마우스를 놓습니다. 트랜지스터-트랜지스터 로직 또는 디지털 카메라의 TTL 출력과 동기화를 위한 미니 스코프를 기록하기 위해 인터페이스 보드로 수집을 시작합니다. 미니 스코프와 동작 동영상 녹화를 시작하고 두 개의 스파우트 냄새 탐색 작업을 위한 자동화 소프트웨어를 켭니다.

그런 다음 MATLAB 코드 synchronize_files_jove.m을 사용하여 냄새 아레나 메타데이터, 기록된 디지털 카메라 프레임 및 미니 스코프 프레임을 동기화합니다. 노름 보정을 사용하여 동기화된 미니 스코프 프레임의 모션 보정을 수행합니다. extract를 사용하여 시간에 따라 변하는 델타 F x F 0 신호로 관심 영역을 식별합니다.

행동 앙상블(Behavior Ensemble)과 신경 궤적 관측소(neural trajectory observatory)를 사용하여 각 개별 시도의 동작과 관심 영역을 시각화합니다. PID 반응은 악취 기둥이 방출될 때 크게 증가하여 악취 전달 시기를 나타냅니다. 냄새 탐색 동안 마우스의 등쪽 CA1에서 여러 칼슘 과도 현상이 관찰되었으며, 이는 냄새 및 물 보상 이벤트와 관련이 있습니다.

칼슘 반응은 시험 시작, 의사 결정 및 복귀를 포함한 탐색 작업의 여러 단계와 관련이 있었습니다. 칼슘 신호에서 쥐의 공간 궤적을 해독하여 냄새와 공간 정보를 매핑하는 등쪽 CA1의 역할을 밝혔습니다.