Name: 인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 학습하세요 인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하는 유세포분석법을 통해 응고제 혈소판 특성을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 혈소판 생물학 및 지혈 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>혈소판 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 미세소포 방출 분석

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>벡크만 쿨터</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A 혈액 채취 튜브</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen 560931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apyrase Grade VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일수화물</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>포도당&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>헤페스&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>이오노포어&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소</td>나트륨 <td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Thrombin&nbsp;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha; IIb 인테그린(CD41, GPIIb) PC7</td><td>벡크만 쿨터</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

프로응고제 혈소판 및 미세소포의 정량화는 Annexin-V 염색을 사용하여 이루어지며, 시료당 최소 50,000개의 이벤트가 기록됩니다. 단계 2.2에서 설명한 바와 같이, 기준선 혈소판 측정은 그림 1A에 나타난 바와 같이 반응 완충액으로 배양된 샘플에서 수행되었습니다. 혈소판 크기는 중앙값 순방향 산란(FSC) 값을 사용하여 측정하였다. FSC는 다양한 요인에 의해 영향을 받지만, 혈소판을 포함한 세포 크기 추정을 위한 일반적인 대용물로 남아 있습니다. 면적의 밀도 플롯(그림 1A)을 사용하여 휴지 혈소판과 방출된 미세소포를 식별하고 게이트했습니다.
비활성화 혈소판의 경우, Annexin-V 염색에 의해 측정된 포스파티딜세린(PS)이 2.9% 미만으로 나타났습니다. 콜라겐 단독으로 또는 트롬빈 또는 칼슘 이온단단과 함께 세척된 혈소판을 활성화하면 PS 노출이 눈에 띄게 증가했습니다. 콜라겐만으로도 PS 양성 혈소판이 26.7% 증가했습니다. 트롬빈은 PS 노출에 대한 영향은 미미했지만(9.1%), 콜라겐과 연관되었을 때 PS 노출 혈소판의 비율을 36.2%로 증가시켰습니다. 참고로 2μM 이오노포를 사용한 치료는 혈소판의 49.6%가 응고가 되는 결과를 보였습니다.
그림 1 은 건강한 개인에서 세척된 혈소판의 미세소포의 기준선 비율이 최소(0.3%)임을 보여줍니다. 트롬빈과 콜라겐은 미세소포 형성을 최소한으로 증가시켰지만, 콜라겐과 트롬빈의 조합만으로 미세소포 형성이 유의하게 증가했습니다(그림 1D; 11.4%). 2μM 이온단을 첨가하면 대조군 혈소판에 의해 형성된 미세소포의 44.0%가 PS에 노출되었습니다.
그림 2 는 이 공정에서 예상되는 변동, 반복성 및 재현성에 대한 정보를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
그림 1: 휴지 및 활성화된 대조군 혈소판에서의 PS 노출 및 미세소포 형성. 혈소판은 30μg/mL 콜라겐(B), 0.5U/mL 트롬빈(C), 콜라겐과 트롬빈(D)과 2μM 이온단을 조합하여 활성화 또는 비활성화(휴지)(A)했습니다. 대표적인 점도표는 혈소판 크기(전방 산채(FSC 로그))와 Annexin-V 결합을 표시합니다. 수평선과 수직선(E)은 혈소판 음성 인구를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
그림 2: ionophore로 배양한 후 PS 노출 및 미세소포 형성의 반복성 및 재현성. 시트레이트(칼슘 킬레이트제)로 처리 또는 처리되지 않은 세척된 혈소판에서 2μM 또는 5μM 이온단으로 배양 한 후 PS 노출 및 미세소포 형성 분석: (A) 4가지 다른 건강한 대조군에서; (B) 5 번 반복 된 하나의 건강한 대조군에서; (C) 두 명의 다른 기술자가 준비한 두 개의 건강한 대조군에서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>전혈 혈소판 수(mL당10-9 )</td>
			<td>상대 원심력(g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 전혈의 혈소판 수와 관련된 혈소판이 풍부한 혈장 준비를 위한 상대 원심력.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>구연산 일 수화물 (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>구연산 삼 나트륨 이수화물 (Na3C6H5O7.2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당 (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24.6 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">용액의 pH를 조정해서는 안 됩니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: acid-citrate-dextrose(ACD) 1L 수용액의 제조.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>구연산 일 수화물 (C6H8O7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7.56 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나오</td>
			<td>4 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">pH를 6.5로 조정합니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: 세척 완충액의 원액 제조.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% 소 혈청 알부민(BSA)</td>
			<td>583 마이크로리터</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0.25 미터</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당</td>
			<td>40의 mg의</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아피라제</td>
			<td>31.5 마이크로리터</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 4: 원액에서 Washing Buffer의 50mL 즉석 용액 제조.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl(2.7mM)</td>
			<td>0.2 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>헤페스(5mM)</td>
			<td>1.19 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0.3 mM</td>
			<td>0.05 지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">pH를 7.4로 조정합니다. 용액을 4°C로 유지하십시오.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 5: 반응 완충액의 원액 제조.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시약</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% 소 혈청 알부민(BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0.25 미터</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당</td>
			<td>50의 mg의</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 6: 원액으로부터 반응 완충액의 50mL 즉석 용액의 제조.

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

학습하세요 인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하는 유세포분석법을 통해 응고제 혈소판 특성을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 혈소판 생물학 및 지혈 메커니즘 연구에 필수적입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

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