인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

혈소판 응고제 형성은 지혈을 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 과정에는 혈소판 표면에서 인지질의 발현과 미세소포 방출이 포함되며, 이는 응고 단계에 필수적입니다. 이 과정에 대한 평가는 다양한 인간 질병에서 혈소판 프로코아고제 반응이 어떻게 나타나는지에 대한 새로운 데이터를 제공했습니다.

유세포 분석은 초석이 되어 왔으며 혈소판 및 미세소포 방출에 대한 포스파티딜세린 발현 평가에서 널리 수용되고 있습니다. 혈액에서 정제된 혈소판을 분리하고 분석하는 것은 시간이 많이 걸리고 전문 실험실 장비가 필요하므로 현재 일상적인 임상 진단에 사용할 수 없습니다. 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 분석하는 것도 크기가 작고 관심 마커에 대한 양성 이벤트 수가 적기 때문에 어렵습니다.

먼저 구연산과 포도당이 함유된 활성 항응고제인 트리소듐시트레이트가 함유된 채취 튜브에 말초 정맥혈을 수집합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 혈액과 항응고제를 섞고 혼합물을 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다. 원심분리를 위한 올바른 속도를 결정하기 위해 자동 세포 카운터를 사용하여 혈소판을 계수합니다.

혈소판이 풍부한 혈장을 준비하려면 브레이크를 적용하지 않고 실온에서 250g의 혈액을 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 ACDA 1ml와 apyrase 6.25ml를 혈소판이 풍부한 혈장 9ml에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 1, 100g에서 원심분리합니다.

Pasture 피펫을 사용하여 혈소판이 부족한 혈장이 있는 상층액을 제거하고 혈소판 펠릿을 1ml의 세척 완충액에 부드럽게 다시 부유시킵니다. 그런 다음 3-4 밀리리터의 세척 버퍼를 튜브에 넣고 다시 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 1ml의 세척 완충액에 다시 현탁시킵니다.

150 마이크로리터의 혈소판 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브에 옮겨 자동 세포 카운터에서 세포를 계수합니다. 나머지 현탁액에 3-4 밀리리터의 세척 완충액을 추가하여 앞서 설명한 대로 추가 세척을 수행합니다. 다음으로, 혈소판 펠릿을 반응 완충액에 다시 현탁시켜 5 x 10에서 리터당 11개의 혈소판의 거듭제곱의 최종 농도를 달성합니다.

먼저 유세포 분석을 위해 원하는 완충액에서 세척된 혈소판을 얻습니다. 반응 완충액에서 모든 작용제와 형광 색소를 준비합니다. 내부 분석의 경우, 50 x 10 농도로 세척된 혈소판 100마이크로리터를 리터당 혈소판 9개의 거듭제곱으로 다른 치료 튜브에 추가합니다.

각 부분 표본을 부드럽게 흔들어 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 희석되지 않은 Annexin V-FITC를 각 마이크로튜브에 5마이크로리터를 첨가하고 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 500마이크로리터의 반응 완충액을 추가하여 공정을 중지합니다.

전방 산란도 또는 FSC를 사용하여 혈소판 집단을 게이트하고 밀도 플롯을 사용하여 각 집단을 독립적으로 식별합니다. 휴지 상태 혈소판 모집단의 맨 오른쪽에 음수 컷오프를 설정합니다. 활성화 후, 이 컷오프의 오른쪽에 있는 이벤트를 포스파티딜세린을 노출시키는 혈소판으로 분류합니다.

미세소포를 구별하기 위해 휴지 혈소판 집단에서 관찰된 가장 낮은 FSC 값으로 컷오프를 설정합니다. 활성화 후 이 임계값 미만의 포스파티딜세린 양성 이벤트를 미세소포로 분류합니다. 기준선 측정은 2.9% 미만의 비활성화 혈소판에서 포스파티딜세린 노출을 나타냈다는 것을 나타냈습니다.

활성화 시 혈소판의 26.7%는 콜라겐으로, 9.1%는 트롬빈으로, 36.2%는 콜라겐과 트롬빈으로 포스파티딜세린 양성이 되었습니다. 이오노포어 처리로 49.6%의 포스파티딜세린 양성 혈소판이 생성되었습니다. 미세소포체의 기준선 비율은 0.3%였으며, 콜라겐과 트롬빈을 함께 사용한 경우에만 약 11.4%가 유의한 증가가 관찰되었으며, 이오단단이 44%로 더 높았습니다.