Name: 세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 배우세요 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별하고 분리하는 방법. 이 기술은 암 줄기세포 연구와 표적 치료 개발에 활용됩니다.

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이 프로토콜에서는 이전에 CG1 균주에서 생성된 GFP 표지 제브라피시 T-ALL 세포를 사용하여 수혜자 합성 CG1 제브라피시15에 직접 주입할 수 있습니다. 간단히 말해서, 백혈병은 단세포 CG1 제브라피시 배아에 rag2:Myc 및 rag2:GFP 의 DNA 미세 주입에 의해 생성되었습니다. 동물은 형광 현미경을 사용하여 주사 후 3주부터 백혈병 발병을 모니터링했습니다. GFP 양성 백혈병 세포를 FACS로 분리하고 수혜자 CG1 제브라피시에 연속적으로 이식하여 고빈도의 LSC를 가진 클론을 생성했습니다. 전체 프로토콜에 대한 자세한 내용은 Blackburn et al.15에 설명되어 있습니다.
대안적으로, 1차 rag2:Myc-유래 T-ALL은 제브라피시 배아17의 DNA 미세주입에 의해 생성될 수 있다. GFP와 같은 rag2 기반 형광 리포터를 사용하여 rag2:Myc 의 DNA 미세 주입은 B 세포, T 세포 및 혼합 ALL18의 발달을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 백혈병 클론은 이전에 T-ALL15로 확인되었습니다. 제브라피시와 관련된 모든 실험 절차는 켄터키 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2019-3399)의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. in vivo 제브라피시 T-ALL 세포 증식 
<ol><li>1mL의 냉동 GFP 표지 제브라피시 T-ALL 세포가 들어 있는 바이알 1개를 37°C 수조에서 부드럽게 흔들어 해동할 때까지 해동합니다. 해동이 끝나면 얼음으로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브의 내용물을 4mL의 생선 배지(0.9x PBS + 5% FBS)가 있는 15mL 원뿔형 튜브에 천천히 피펫팅하여 동결 매체를 희석합니다.</li>
	<li>4°C에서 2,500× g 에서 5분 동안 스핀 다운합니다. 펠릿에서 매체를 제거합니다. 0.5mL의 생선 배지에 재현탁시키고 세포를 얼음 위에 유지합니다.</li>
	<li>세포를 세고 필요한 경우 100,000 cells/5 μL로 희석합니다.</li>
	<li>페트리 접시에 200mL의 어류 시스템 물 25mL에 4mg/mL 마취제(MS-222) 25μL를 첨가하여 성인 CG1 제브라피시를 마취합니다. CG1 물고기를 복부 쪽이 위로 향하게 잡고 Hamilton 마이크로리터 주사기를 사용하여 복강내(IP) 공간에 5-6μL를 주입합니다. 동물을 수조로 다시 옮기고 시스템에 다시 넣기 전에 정상적인 수영으로 돌아가는지 모니터링합니다. 참고: 60일 이상의 성인 제브라피시가 이 프로토콜에 설명된 이식 연구에 사용되었습니다.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 일주일에 한 번 백혈병 성장을 모니터링합니다. 심사 절차에 대한 자세한 내용은 아래 섹션 2를 참조하십시오.</li>
</ol>2. 형광 표지된 백혈병 세포의 채취
<ol><li>이식 후 약 21-28일 후, 페트리 접시에 25mL의 어류 시스템 물에 4mg/mL 마취제 200μL(4-5방울)를 첨가하여 성인 CG1 제브라피시를 마취합니다.</li>
	<li>GFP 형광을 검출하기 위해 적절한 필터를 사용하여 epifluorescent microscope로 동물에서 GFP 표지된 백혈병 세포의 비율을 평가하여 CG1 제브라피시의 백혈병 부담을 검사합니다. GFP 양성 백혈병은 동물의 &gt;70%에 퍼진 경우 수확할 준비가 된 것입니다.</li>
	<li>9mL의 어류 시스템 물이 들어있는 페트리 접시에 4mg/mL 마취제 1mL를 추가하여 동물을 안락사시킵니다. 생명의 모든 징후가 멈추게 하십시오. 예를 들어, 물고기가 수술 움직임이 멈추는지 관찰하십시오 (~ 5 분).</li>
	<li>제브라피시를 새 페트리 접시에 옮기고 세포의 완충액 역할을 할 생선 배지 1mL를 추가합니다. 새 면도날을 사용하여 먼저 제브라피시의 목을 베고 동일한 면도날을 사용하여 조직을 침수합니다. 큰 세포 덩어리를 제거하기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다.</li>
	<li>40μm 세포 여과기를 통해 세포를 50mL 코니컬 튜브에 통과시켜 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 세포를 얼음 위에 두십시오.</li>
</ol>3. 염색 및 제브라피시 세포 생존율을 위한 세포 증식 염료(CellTrace Far Red) 농도 최적화
참고: 이 프로토콜의 경우 종양 세포가 GFP 라벨링되어 있기 때문에 CT-FR이라고 하는 스펙트럼 중복을 피하기 위해 원적색 세포 증식 염료(CellTrace Far Red)를 사용했습니다.
<ol><li>제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 양의 DMSO를 추가하여 사용 직전에 형광 염료 1mM 용액을 준비합니다. 1mM, 0.5mM, 0.1mM 및 0.01mM의 작업 솔루션이 있습니다. 염색 후 세포 생존력을 테스트하기 위해 필요에 따라 어류 배지에 희석합니다.</li>
	<li>세포 수를 세고 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 1 × 106 개의 세포를 수집합니다.</li>
	<li>4°C에서 2,500× g 으로 5분 동안 원심분리기 액체를 제거하고 세포를 0.9x PBS 1mL에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>CT-FR로 처리하기 위해 세포 현탁액을 각각 250μL의 튜브 4개로 분할합니다.</li>
	<li>250 μL의 0.9x PBS를 추가하여 약 250,000개의 세포/튜브로 각각 500 μL의 부피를 만듭니다.</li>
	<li>위에서 설명한 작업 용액의 필요한 양을 4개의 튜브 각각에 추가하여 1μM, 0.5μM, 0.1μM 및 0.05μM의 최종 농도를 얻습니다. 빛으로부터 보호된 37°C에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>실온에서 2,500 × g 에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화합니다. 액체를 제거하고 500μL의 생선 배지로 세포를 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.</li>
	<li>다시 펠렛하고 액체를 제거한 다음 25μL의 어류 배지에 재현탁시킵니다. 1 μL를 사용하여 50% 트리판 블루로 1:10 희석하여 세포를 계수합니다.</li>
	<li>세포 생존력을 위해 현미경으로 세포를 검사합니다. 살아있는 세포는 트리판 블루를 유지하지 않고 현미경으로 볼 때 밝게 보이는 반면, 죽은 세포는 염료를 흡수하여 어둡게 보입니다. 먼저 적절한 형광 채널 아래의 세포를 검사하여 종양 세포를 식별한 다음 명시야 채널을 사용하여 세포 생존율을 평가합니다.</li>
	<li>세포 생존율을 유지하면서 성공적인 염색을 할 수 있는 농도를 선택합니다(&gt;90% 트리판 블루-음성 세포). 참고: 이 실험에서 테스트한 제브라피시 T-ALL 세포의 경우 성공적인 염색을 위해 1μM 농도가 사용되었으며 세포 생존율의 &gt;90%가 사용되었습니다.</li>
</ol>4. 생체 내에서 CT-FR 염색된 T-ALL 제브라피시 세포 증식
<ol><li>섹션 3에서 최적화된 CT-FR 농도를 사용하여 제브라피시 세포를 염색합니다. FACS 분류 중 GFP 양성 대조군으로 GFP 표지 T-ALL 종양의 생성을 위해 일부 종양 세포를 염색하지 않은 상태로 둡니다. 이식을 위해 염색된 세포와 염색되지 않은 세포를 모두 50,000 cells/5 μL로 희석합니다.</li>
	<li>페트리 접시에 200mL의 어류 시스템 물 25mL에 4mg/mL 마취제 200μL를 추가하여 성인 CG1 제브라피시를 마취합니다.</li>
	<li>염색된 세포와 염색되지 않은 세포 모두에 대해 섹션 1에 설명된 대로 세포 현탁액 5μL를 제브라피시의 IP 구멍에 주입합니다. 주사 후 잠재적인 사망률을 고려하기 위해 그룹당 5-6마리의 제브라피시를 주입합니다.</li>
	<li>백혈병 발병을 위해 매주 2회 진정제 하에 형광 현미경으로 동물을 검사합니다. 참고: ~10-14일 후, 백혈병은 이 몸의 약 30-40%를 차지해야 합니다. 이 기간 내에 백혈병 수확 및 후속 분류를 계획하십시오. 종양이 큰 크기로 확장될 때까지 기다리면 형광 세포 염료가 더 많이 희석되고 신호를 감지하기 어려울 수 있습니다. 선택한 종양 모델에 대한 종양 수확 시기의 최적화를 고려하십시오. 또한 원하는 종양 크기를 캡처하기 위해 더 자주 종양을 모니터링하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. CT-FR 염색 제브라피시 T-ALL 세포 분류 준비
<ol><li>세포 분류를 위해 다음 컨트롤을 준비합니다: 색상 제어 없음(야생형 제브라피시에서 추출한 염색되지 않은, 비유전자 변형, 단일 세포 현탁액), GFP-Labeled T-ALL 세포 및 새로 염색된 CT-FR WT 제브라피시 세포(Far-Red 신호의 최대 임계값 설정용).</li>
	<li>염색되지 않은 대조군 및 CT-FR 대조군 준비<ol><li>9mL의 어류 시스템 물이 들어 있는 페트리 접시에 4mg/mL 마취제 1mL를 추가하여 이식되지 않은 CG1 제브라피시를 안락사시켜 야생형(WT) 어류 세포를 수확합니다.</li>
		<li>제브라피시를 새 페트리 접시에 옮기고 세포의 완충액 역할을 할 생선 배지 1mL를 추가합니다. 새 면도날을 사용하여 먼저 목을 베고 동일한 면도날을 사용하여 제브라피시를 침식시키십시오. 큰 세포 덩어리를 제거하기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다.</li>
		<li>40μm 세포 여과기를 통해 세포를 50mL 코니컬 튜브에 통과시켜 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 세포를 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>CT-FR 제어의 경우 250,000 WT 세포를 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 2,500 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다. 생선 매체를 제거하고 500μL의 0.9x PBS+ 1% FBS를 추가합니다.</li>
		<li>최종 농도 1μM를 위해 1mM CT-FR 염료 원액 0.5μL를 추가합니다. 1,000μL 피펫으로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. 빛으로부터 보호된 상태에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>액체를 제거하고 500μL의 생선 배지로 세포를 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.</li>
		<li>원심분리로 세포를 다시 펠렛화하고 액체를 제거한 다음 세포를 0.9x PBS+ 1% FBS 500μL에 재현탁시키고 35μm 필터 캡을 통해 FACS 튜브로 통과시킵니다. 얼음 위에 두십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>기증자 플레이트 준비 참고: 기증자 플레이트는 이식된 제브라피시에서 CT-FR 염색된 T-ALL 세포를 분류하는 96웰 V-바닥 플레이트입니다. 플레이트의 각 웰에는 50μL의 어류 배지에 5,000개의 염색되지 않은 WT CG1 세포가 들어 있어 후속 단계에서 분류된 세포를 펠릿화하는 데 도움이 되는 운반체 역할을 합니다.<ol><li>500,000 WT CG1 세포를 계수하여 15mL 코니컬 튜브에 전달합니다.</li>
		<li>5mL의 생선 배지를 추가하여 이 세포 스톡을 100세포/μL로 희석합니다.</li>
		<li>50μL의 셀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 세포 현탁액 균질성을 유지하기 위해 각 행 뒤에 세포 현탁액 스톡 튜브를 혼합합니다. 분류할 때까지 플레이트를 4°C로 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>이식된 물고기 샘플 준비<ol><li>30-40% T-ALL 부담으로 이식된 물고기를 선택하십시오. CT-FR 염색 세포와 염색되지 않은 GFP 종양 세포를 모두 이식한 물고기를 수집합니다.</li>
		<li>섹션 2에 설명된 대로 세포를 채취합니다. 참고: 염료 보유 세포는 소량으로 존재할 것으로 예상되므로 CT-FR GFP 샘플에서 많은 수의 세포를 분류할 준비를 하십시오.</li>
		<li>0.9x PBS + 1% FBS에서 ~3-5 × 106 cells/mL를 분류하기 위한 적절한 농도로 희석하고 35μm 필터 캡을 통해 FACS 튜브에 통과시킵니다. 1:1,000 희석액으로 DAPI(1mg/mL)를 필수 염료로 첨가하여 죽은 세포를 배제합니다. 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>염색되지 않은 GFP 종양 세포의 경우 250,000개의 세포를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 실온에서 5분 동안 2,500× g 의 펠릿으로 이송합니다. 생선 배지를 제거하고 500μL의 PBS를 추가한 다음 35μm 필터 캡을 통해 FACS 튜브에 넣습니다. 얼음 위에 두십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 정렬
알림: 분류에 사용할 때를 제외하고 모든 튜브와 기증자 플레이트를 얼음 위에 두십시오.
<ol><li>파라미터와 게이트를 정렬하려면 먼저 전방 및 측면 산란 게이팅을 적용하여 크기에 따라 관심 세포를 식별하고 세포 파편을 제거합니다. 다음으로, 전방 분산 높이와 전방 분산 영역을 사용하여 중복 셀을 제외하고 단일 셀만 유지합니다. 마지막으로, no-color 및 single-color 컨트롤을 사용하여 GFP 양성 및 CT-FR 양성 세포 집단을 식별하기 위한 사분면을 그립니다. 참고: CT-FR 대조군은 대조군의 염색이 세포 분열 없이 신선하게 이루어졌기 때문에 분류를 위한 샘플보다 훨씬 밝을 것으로 예상됩니다. CT-FR GFP 샘플의 세포는 CT-FR 양성 게이트의 하단에 나타날 것으로 예상됩니다.</li>
	<li>각 물고기에 이식할 세포의 수를 기증자 플레이트의 한 웰로 분류합니다. 참고: 이 실험에서는 제한 희석 분석을 사용하여 CT-FR High 및 CT-FR Low에서 백혈병 줄기 세포의 빈도를 추정했습니다. 이 분석은 3 마리의 동물에 이식 된 25 개의 세포와 10 마리의 동물에 이식 된 10 개의 세포를 사용했습니다. 제브라피시 rag2:Myc 유래 T-ALL을 사용하는 일반적인 제한 희석 분석에는 이 모델의 LSC 빈도가 수백 개의 세포에서 1 LSC로 추정되기 때문에 세포 수가 더 많은 그룹(500 또는 1,000)이 포함됩니다. 그러나, 이 분석에서는, 우리는 이전에 Blackburn et al.15에 의해 기술된 T-ALL 클론 중 하나를 사용하고 있다. 여기에 사용된 샘플의 LSC 주파수는 수십 개의 셀에서 ~1 LSC입니다. 우리는 25개의 세포군에 이식된 동물에서 백혈병이 검출될 것으로 예측합니다. 질병 모델에 대해 이 분석을 최적화할 때 종양의 생착을 보장하기 위해 더 높은 세포 수 그룹을 선택할 때 주의를 기울여야 합니다.</li>
	<li>분류 후 이식 준비가 될 때까지 접시를 얼음 위에 두십시오. 참고: 분류 절차는 스트레스가 많을 수 있으며 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제 제한 희석 실험을 실행하기 전에 파일럿 선별 실험이 수행되었습니다. 분류된 세포를 이식하고 백혈병 발병을 모니터링하여 분류가 세포 생존력에 해로운지 확인했습니다. 또는 분류된 세포를 Trypan blue로 염색하고 이식 전에 현미경으로 검사하여 세포 생존율을 평가할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 희석을 제한하고 종양 발병을 추적하면서 분류된 세포를 이식합니다.
<ol><li>4°C에서 2,500× g 의 대형 탁상형 원심분리기를 사용하여 플레이트를 회전시킵니다.</li>
	<li>각 웰에서 45μL의 상층액을 조심스럽게 제거하고 5μL의 액체를 남기고 웰 바닥의 세포 펠릿을 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>20μL 피펫으로 세포를 재현탁시킵니다. 피펫으로 2-3 웰을 재현탁 한 다음 Hamilton 마이크로 리터 주사기를 사용하여 각 웰의 세포 현탁액을 IP 이식을 통해 원하는 수의 CG1 제브라피시에 주입합니다. 그런 다음 세포가 재정착하는 것을 방지하기 위해 다음 웰 그룹에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>최소 6주 동안 T-ALL 발달을 위해 매주 한 번 진정제 하에 형광 현미경으로 제브라피시를 검사합니다.</li>
</ol>8. 백혈병 줄기세포 빈도 측정
<ol><li>이식 후 6주에 세포 용량 및 치료군당 양성 동물의 수를 기록하고 GFP 신호의 양이 있는 동물을 양성으로 간주합니다. GFP 신호가 신체의 &gt;50%를 차지할 때 동물이 상당한 백혈병 부담을 가지고 있다고 생각하십시오.</li>
	<li>웹 기반 ELDA(Extreme Limiting Dilution Analysis) 통계 소프트웨어(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19를 사용하여 각 세포 집단 내에서 LSC의 빈도를 계산합니다. 참고: 워크플로의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig01.jpg"> 그림 1: 제브라피시 T-ALL 모델에서 정지 세포를 분리하기 위해 세포 추적 염색을 사용하기 위한 워크플로우. 세포 증식 염색으로 제브라피시 T-ALL 세포 염색, CG1 제브라피시로 증식(상단 패널), 세포 증식 염색의 머무름에 따른 세포 분류(중간 패널)의 개략도. 수집된 세포는 LSC(하단 패널)의 빈도를 측정하기 위한 제한 희석 분석에 사용되었습니다. 약어: T-ALL = T-세포 급성 림프구성 백혈병; LSC = 백혈병 줄기 세포; CT-FR = CellTrace 원적색; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>세포 증식 염료 분류를 사용한 제브라피시 T-ALL의 LSC 빈도 추정

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<li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+t+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+akt%2Fmtorc1+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer+avatars%3A+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).</li>
<li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. (53), e2790(2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+b+and+t+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+myc%3A+Implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).</li>
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<li>Bhojwani, D., Pui, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed+childhood+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia.</a> Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).</li>
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<li>Al-Hamaly, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+drug+screening+identifies+erlotinib+as+an+inhibitor+of+wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+and+self-renewal+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Biomed Pharmacother. 170, 116013(2024).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+engrafted+human+cancer+and+therapy+responses+in+immunodeficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>26 G/2" 마이크로 주사기</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>NA</td></tr><tr><td>35 &micro; m 필터 캡 FACS 튜브</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>NA</td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>CELLTREAT</td><td>229482</td><td>NA</td></tr><tr><td>96-well skirted PCR plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0800</td><td>NA</td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>Sony Biotechnology</td><td>SY3200</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34564</td><td>NA</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브</td><td>VWR</td><td>10026-078</td><td>NA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dulbecco's인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Caisson Labs</td><td>22110001</td><td>NA</td></tr><tr><td>Epifluorescence 실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fish system water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>0.03-0.05% 염도, pH 6.5-8, 중탄산나트륨</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td>로 완충 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2171</td><td>NA</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Pentaire</td><td>TRS-1</td><td>트리카인 메실레이트, 마취제</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>07-202-011</td><td>NA</td></tr><tr><td>면도날</td><td>American Line</td><td>66-0089</td><td>NA</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher 과학적</td><td>T10282</td><td>북미</td></tr></tbody></table>

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 t 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

위에서 설명한 프로토콜에 따라 세포 증식 염료인 CT-FR을 유지한 세포를 분류하고 이를 제한 희석 분석(LDA)에 사용하여 CT-FR High 및 CT-FR Low 집단에서 LSC 빈도를 추정했습니다. 유세포 분석 실험에 대한 게이팅을 설정하기 위해 단색 대조군 외에 형광단 없음(색상 없음) 대조군을 사용했습니다 (그림 2A). 이러한 사분면은 분류 게이트 설정을 위해 FITC 및 PE 양성 및 음성 모집단을 식별하는 데 사용되었습니다. CT-FR 단색 양성 대조군은 이식되지 않은 제브라피시에서 WT 세포를 염색하여 분류 당일에 준비되었으므로 신호 강도는 샘플에서 전파된 세포의 신호보다 훨씬 높을 것으로 예상됩니다.
CT-FR 염색된 GPF T-ALL(그림 2B)에서 0.13%의 낮은 빈도로 우측 상단 사분면에 나타나는 세포는 CT-FR High로 간주되었으며 "CT-FR high"로 표시된 분류 게이트가 이 사분면에 배치되었습니다. CT-FR Low인 백혈병 세포를 수집하기 위해 오른쪽 하단 사분면에 또 다른 게이트를 만들었습니다. CT-FR High cell은 종양 샘플에서 낮은 농도로 존재했기 때문에 제한 희석 실험에 필요한 수의 세포를 수집하기 위해 많은 수의 세포(~2.5 × 10,6)를 분류했습니다.
CG1 제브라피쉬에 LDA를 위해 분류된 세포를 이식한 후, 제브라피시를 6주 동안 모니터링했습니다. CT-FR High의 세포는 CT-FR Low 세포 집단(p = 0.0134)에 비해 LSC 주파수가 4배 더 높았습니다(그림 3A). 이식 후 28일째 되는 날의 동물의 대표적인 이미지가 (그림 3B)에 나와 있습니다. CT-FR High, 10 cell dose 그룹에서는 9마리 중 8마리(89%)에서 백혈병이 발병한 반면, CT-FR Low 그룹에서는 10마리 중 2마리(20%)가 백혈병에 걸렸다(그림 3A). CT-FR High 그룹의 동물은 백혈병에 대한 잠복기가 현저히 짧았습니다(p = 0.0014)(그림 3C). 마지막으로, CT-FR High의 동물은 전체 생존율이 현저히 낮았습니다(p = 0.0408)(그림 3D). 6주차에 CT-FR Low 동물의 70%가 살아 있는 반면 CT-FR High 동물은 10%에 불과했습니다. 이러한 결과는 rag2:Myc 기반 제브라피시 T-ALL 모델에서 천천히 분열하는 정지 세포 집단 내에서 자가 재생 LSC의 농축과 이 집단을 분리하기 위한 세포 증식 염색의 활용을 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig02.jpg"> 그림 2: 유세포 분석을 사용한 세포 분류. (A) 갓 CT-FR로 염색된 WT 세포와 GFP-표지된 T-ALL 세포의 FACS 플롯을 사용하여 CT-FR 염색된 WT 세포를 분류하기 위한 게이트를 생성했습니다. GFP+ T-ALL 세포. (B) 증식된 CT-FR 염색된 GFP+ T-ALL 세포의 대표적인 예. 오른쪽 상단 사분면의 셀은 CT-FR High로 간주되었고 오른쪽 하단 사분면의 셀은 CT-FR Low로 간주되었습니다. 약어: T-ALL = T-세포 급성 림프구성 백혈병; CT-FR = CellTrace 원적색; GFP = 녹색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린; FACS = 형광 활성화 세포 분류; WT = 와일드 타입. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig03.jpg"> 그림 3: 세포 증식 염색의 머무름이 높은 세포에서 상당히 더 높은 LSC 빈도. (A) 이식 후 두 가지 용량의 세포(10개 및 25개 세포)를 증가시킨 백혈병 양성 동물의 수를 나타내는 제한 희석 분석의 데이터. 계산된 LSC 빈도와 95% 신뢰 구간이 명시되어 있습니다(p = 0.0134). (B) 이식 후 28일 후의 동물의 대표 이미지; 척도 막대 = 10mm. (C) 동물의 &gt;50%가 GFP 양성이 되는 데 필요한 시간으로 간주되는 중대한 백혈병에 대한 잠복기로, 상당한 백혈병 부담을 나타냅니다. (D) 10개의 세포를 이식한 동물의 생존 곡선. 약어: LSCs = 백혈병 줄기 세포; CT-FR = CellTrace 파 레드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

identification-quiescent-cells-zebrafish-t-cell-acute-lymphoblastic

Research

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제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포를 분리하고 트리판 블루 염료를 사용하여 정량화하는 기술을 설명합니다.

형광 표지된 T-ALL 세포 분리: 성체 제브라피시에서 T-ALL 세포를 분리하는 방법

다음 프로토콜은 줄기세포로 구성된 T-세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포의 측면 집단을 성체 제브라피시에서 분리하는 방법을 설명합니다. 측면 모집단에는 눈에 띄는 세포 마커가 없기 때문에 Hoechst 33342 염료 유출 분석을 사용하여 분리합니다.

Side Population Assay: 제브라피시에서 종양 세포의 Side Population을 분리하는 방법

여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

여기서는 종양 거동 분석, 전산 면역형화 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

이 프로토콜은 유세포 분석을 사용한 약물 반응 평가 지침과 함께 일시적 면역 억제 제브라피시 배아의 세포주 및 신선한 환자 물질에서 인간 급성 림프구 백혈병(ALL) 이종이식편을 생성하고 문제를 해결하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 실험 파이프라인은 고형 종양에도 적용할 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 백혈병 세포 이식을 사용한 신속한 생체 내 약물 반응 예측

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

배우세요 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별하고 분리하는 방법. 이 기술은 암 줄기세포 연구와 표적 치료 개발에 활용됩니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별

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