Name: Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 배우세요 Gibson Assembly 기반 분자 클로닝 CURE 교육 모듈을 통해 학생들의 실험 이해도와 자신감을 향상시키는 방법. 자연산물 생합성 연구용 신규 플라스미드 클로닝 실습이 포함됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>분자 생물학 교육 및 기술 향상을 위한 Gibson Assembly 구현

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

학부생에게 기본적인 분자 생물학 개념 및 실험실 기술을 교육하는 것은 학계 및 산업을 포함한 다양한 연구 환경에서 일반적이기 때문에 학부생의 과학 및 전문성 개발에 매우 중요합니다. 따라서 캘리포니아 폴리테크닉 주립대학교(California Polytechnic State University, San Luis Obispo, Cal Poly)에서 생물학(분자 및 세포 생물학 집중) 및 생화학 전공 학생들은 이러한 주제(CHEM/BIO 475)를 배우고 적용하기 위해 상위 부문 분자 생물학 실험실 과정을 이수해야 합니다. 이 과정의 기본 커리큘럼은 이전에 개발되었으며, 학생들은 효모 상보적 DNA(cDNA) 주형1에서 준비된 액틴 함유 플라스미드를 조립하기 위해 토포이소머라아제 기반(TOPO) 클로닝을 수행합니다. 학생들은 실제 연구 가설을 모방한 질문을 기반으로 실험을 설계하여 실험실 실습 및 탐구 기반 학습에 대한 친숙도를 높입니다. 분자 생물학 분야의 지속적인 발전은 학생들이 노동 인구를 위한 현대적인 역량을 갖출 수 있도록 해당 커리큘럼을 조정해야 합니다. 특히, Gibson Assembly의 사용은 과학계에서 더욱 우세해졌습니다. 이 방법은 원래 인공 염색체2를 합성하기 위해 확립되었지만, 이 보고서 작성 당시 5,000개 이상의 출판물에서 Gibson et al.의 원본 연구를 참조했습니다. Gibson Assembly는 기존 클로닝 방법론과 비교할 때 독특합니다: 사용자 정의가 가능하며 접합부를 생성하기 위한 제한 부위 없이 여러 선형 DNA 단편을 쉽게 접합할 수 있습니다. 따라서 우리는 CHEM/BIO 475 커리큘럼을 수정하여 현대 분자 복제 기술을 통합하고 탐구 기반 과정 모델을 개선할 수 있는 기회를 보았습니다.
학생의 연구경험이 과학에 대한 개념 이해, 기술 개발 및 끈기 향상에 기여하는 것으로 확인되었지만3 모든 학부생이 연구실에 직접 참여할 수 있는 기회를 갖는 것은 아닙니다. 연구 실험실에서 제한된 학생 수용 능력의 문제를 해결하기 위해 강의 기반 학부 연구 경험(CURE)이 개발되고 채택되어 교실에서의 진정한 연구를 통해 과학적 접근성을 높입니다. CURE는 구현에 있어 다양하지만 과학 연구의 다섯 가지 원칙을 다루는 일반적인 관행이 확립되었습니다. 잘 설계된 CURE에서 학생들은 1) 과학적 관행을 사용하고, 2) 연구 프로젝트에 협력하고, 3) 새로운 발견을 시도하고, 4) 교실 밖에서 관련 작업에 기여하고, 5) 실험 실패의 경우 가설과 방법을 재평가하고 수정합니다4. 실험실에서의 전통적인 학생 연구 경험과 유사하게, CURE는 과학, 과학적 기술, 프로젝트 소유권 및 과학, 기술, 공학 및 수학(STEM)에 대한 인내심에 대한 학생의 자신감을 강화하는 것으로 나타났습니다5. 분자 클로닝과 관련된 CURE는 이전에 보고되었지만, 6,7,8,9,10,11,12,13, 진정한 연구 플라스미드 라이브러리를 만들기 위한 Gibson Assembly의 적응성을 강조하는 사례는 없습니다.
여기에서는 San Luis Obispo에 있는 California Polytechnic State University의 현재 탐구 기반 CHEM/BIO 475 커리큘럼을 두 가지 주요 개선 사항으로 확장한 것을 보고합니다: Gibson Assembly를 사용한 실습 경험과 National Science Foundation(NSF-1708919 및 NSF-2300890)에서 자금을 지원하는 연구 프로젝트를 위한 독창적인 플라스미드 구조를 제공한 CURE에 대한 학생 참여. 이 커리큘럼을 세 번 이상 구현한 학생들은 방선균에 의해 생성된 생체 활성 분자의 천연 제품 생합성에 초점을 맞춘 두 가지 별개의 연구 프로젝트에 기여했습니다. 천연물에는 항생제, 항진균제 및/또는 항암 활성을 가진 약전이 함유되어 있는 경우가 많기 때문에 이러한 소분자는 신약 개발 노력에 중요한 역할을 하고 임상적 관련성을 가질 수 있다14. 이 연구는 박테리아 생합성 효소의 기능과 엔지니어링 잠재력을 모두 조사할 수 있도록 플라스미드 라이브러리를 생성해야 합니다. 이 CURE에서 학생들은 이러한 연구 프로젝트와 관련된 고유한 플라스미드 라이브러리를 복제하기 위해 Gibson Assembly 실험을 설계하고 수행했습니다(그림 1). 또한 모듈의 형식과 디자인은 다른 연구 프로젝트에서 관심 있는 플라스미드를 생성하도록 쉽게 조정할 수 있기 때문에 독특합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
그림 1: 우리 연구소에서 Gibson Assembly의 역할에 대한 개요. 방선균(actinomycetota)은 생합성 효소를 암호화하는 유전자 클러스터를 사용하여 임상적으로 관련된 생체 활성을 가진 저분자 천연 제품을 생산합니다. 본 연구에서는 암호화된 효소의 기능에 대한 다운스트림 조사를 위해 Gibson Assembly를 통해 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드를 조립합니다. Biorender.com 의 과학 아이콘. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
연구실 개요
분자생물학 연구실은 분자 및 세포 생물학에 집중하는 생화학 전공 및 생물학 전공자에게 필요한 상위 부문 과정입니다. 전제 조건을 충족하는 다른 학생들은 상위 부문 선택 과목으로 과정을 수강할 수 있습니다. 이 과정은 Cal Poly의 화학 및 생화학과와 생물학과가 공동으로 연계되어 있습니다. 두 학과의 교수진이 매 학기마다 교대로 과정을 가르칩니다(생물학 2/4, 화학 및 생화학 1/4).
수업은 매주 두 번 실험실에서 170분 동안 만나고 일주일에 한 번 50분 강의를 위해 만납니다. 랩 섹션에는 최대 16명의 학생이 포함되며 매 분기마다 2-3개의 랩 섹션이 제공됩니다. 이 과정은 10주 동안 진행되며 기말고사는 10주 마지막 회의에서 시행됩니다. 강의 시간은 실험실에서 수행되는 많은 실험 기술의 이면에 있는 이론과 실험실에서 다루지 않는 분자 생물학의 최신 주제에 대해 토론하는 데 사용됩니다. 실험실의 핵심 커리큘럼은 효모1에서 액틴 유전자를 복제하는 과정을 포함하며, 이는 약 7주(13-14회의 실험실 회의)가 소요됩니다. 이 기술에는 마이크로피펫팅, 효모 RNA 분리, 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용한 효모 유전자 증폭, TOPO 클로닝, 청백색 스크리닝, 플라스미드 분리 및 제한 분해 및 PCR에 의한 인서트 검증, 클론의 인실리코 분석, DNA 염기서열 분석 등이 포함됩니다. 과정의 마지막 3주 동안의 커리큘럼은 강사의 재량에 달려 있지만 정의되지 않은 결과로 "독립적인 프로젝트"를 완료하는 학생과 관련이 있습니다.
실험 개요
우리 연구 그룹의 초점 중 하나는 방선균의 생합성 경로입니다. 독립적인 프로젝트를 설계할 때 우리는 학생들이 천연 제품 생합성을 조사하는 연구 프로젝트에 사용하기 위해 Gibson Assembly를 통해 플라스미드를 만드는 것을 구상했습니다. 여기에서 평가된 교육과정 모듈의 반복은 생합성 경로의 조작을 가능하게 하는 플라스미드에 국한된 것이지만, Gibson Assembly 워크플로우는 다른 분자 클로닝 프로젝트에도 매우 적합합니다(그림 2). 워크플로우는 3개의 서로 다른 실험(A, B, C)으로 나뉘어 2개의 강의 기간과 6개의 실험 기간(총 3주)에 걸쳐 완료되었습니다( 보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 실험에 앞서 학생의 준비를 지원하고 학생의 이해도를 평가하기 위한 워크시트가 있었습니다(보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5). 워크플로우는 강사의 필요와 관심에 유연하게 맞는 형식으로 제공됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
그림 2: Gibson Assembly 모듈 워크플로우. 1일차와 4일차는 학생들이 인실리코(in silico ) 염기서열 분석 및 실험 설계를 완료하는 강의 시간입니다. 2-3일차와 5-8일차는 실험실 회의로, Gibson Assembly를 통해 새로운 플라스미드를 복제하는 단계를 수행한 후 분리 및 스크리닝을 수행합니다. 그림 순서도는 학생들이 수행하는 세 가지 실험(A, B, C)으로 그룹화됩니다. 자세한 지침과 프로토콜은 각각 Supplemental File 1 및 Supplemental File 2 로 제공된 강사 및 학생 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. Biorender.com 의 과학 아이콘. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
Gibson Assembly 독립 프로젝트 모듈은 2019년 봄 분기에 CHEM/BIO 475에서 처음 시범 운영되었습니다. 2020년과 2021년에는 SARS-CoV-2 전염병으로 인해 이 과정이 온라인으로 진행되었습니다. 2022년과 2023년 봄에 대면 수업이 재개되었을 때, 이 과정에 참여한 학생들은 연구 관련 플라스미드를 복제하는 Gibson Assembly 독립 프로젝트의 학습 결과를 평가하는 연구에 참여하도록 초대되었습니다. 2019년에 학생들은 pKC1132로 복제된 Micromonospora echinospora ATCC 15837 게놈의 유전자 카세트로 구성된 플라스미드 라이브러리를 만들었습니다(그림 3). 이 플라스미드 라이브러리는 천연 산물 TLN-0522015에 대한 추정되는 생합성 유전자 클러스터에서 관심 유전자를 비활성화하기 위해 당사 연구실에서 활용되고 있습니다. 유전자 불활성화 연구를 보완하기 위해 2022년 학생들은 추정되는 TLN-05220 유전자 클러스터의 작은 유전자 라이브러리를 pUC19(Figure 3)로 복제했습니다. 우리 연구 그룹은 단백질 과발현 및 정제를 위해 pET28b를 포함한 발현 벡터로 유전자를 subcloning하기 위해 이러한 플라스미드를 활용했습니다. 2023년 코호트의 학생들은 에폭소미신 합성효소16에 대한 생합성 공학 프로젝트의 지속적인 작업에 기여했습니다. 3-4명으로 구성된 팀으로 학생들은 연구실에서 이러한 효소의 과발현 및 정제를 최적화하기 위해 비리보솜 펩타이드 synthetase17 모듈의 엔지니어링된 도메인을 다양한 단백질 발현 벡터로 복제했습니다(그림 3). 중복성은 각 코호트에 대한 복제 계획에 구축되었습니다. 예를 들어, 2019년 코호트에는 44명의 학생이 포함되어 있었고 15개의 플라스미드가 클로닝을 위해 수업에 할당되었습니다. 따라서, 각 플라스미드의 클로닝을 2회 또는 3회 시도하였다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
그림 3: 2019년, 2022년 및 2023년 독립 프로젝트 반복 동안 복제된 플라스미드 및 학생 참가자 요약. Gibson Assembly 프로젝트는 세 번 배포되었습니다. 각 제안에서 학생 참가자들은 생합성 경로를 탐구하는 연구 프로젝트에 활용하기 위해 서로 다른 플라스미드 라이브러리를 복제했습니다. 2019년과 2022년의 프로젝트는 두 개의 단편(하나의 유전자 카세트 또는 유전자와 벡터) Gibson Assembly 반응을 포함하는 천연 제품 TLN-0522015 에 대한 지속적인 작업을 지원했습니다. 2023년 프로젝트에는 에폭소마이신 생합성에 관여하는 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRPS) 효소의 모듈 1 및 2 내 도메인 스와핑이 포함되었습니다16. 부화한 조각은 스왑된 도메인의 두 개의 서로 다른 돌연변이를 나타내고 단색은 스왑되지 않은 도메인을 나타냅니다. 총 8개의 서로 다른 유전자 단편(모듈 1에 4개, 모듈 2에 4개)이 Gibson Assembly와 호환되는 돌출부로 생성되었습니다. 각 모듈에 대해 3개의 유전자 단편의 2가지 다른 조합을 2개의 서로 다른 벡터(pBAD33 및 pET28, 조립당 총 4개의 단편) 중 하나로 조립하여 8개의 엔지니어링된 NRPS 플라스미드를 생성할 수 있었습니다. Biorender.com 의 과학 아이콘. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
평가 개요
Gibson Assembly 독립 프로젝트가 시작되기 최소 1주일 전에 2022년 및 2023년 코호트의 학생들은 Cal Poly18의 생화학 실험실 과정 조사에서 수행된 연구와 유사하게 설계된 학습 결과 조사에 참여하도록 초대되었습니다. 학생 참가자들은 독립 프로젝트가 시작되기 전에 실험실 회의에서 객관식 사전 설문지를 작성했고, 최종 실험실 회의(즉, Gibson Assembly 모듈을 완료한 후)에서 객관식 사후 설문지를 작성했습니다. 사전 및 사후 설문지는 28개의 동일한 질문으로 구성되었으며 사후 설문지에 2개의 추가 질문(총 30개)이 있었습니다. 분자 복제와 관련된 효소 및 메커니즘(예: 중합효소 연쇄 반응[PCR], Gibson Assembly, 형질전환, 청백색 스크리닝)에 대한 학생들의 지식을 평가하기 위해 10개의 내용 질문이 작성되었습니다. 다음 7개의 질문은 학생들에게 분자 복제 용어(예: DNA 중합효소, 엑소뉴클레아제, 리가아제)에 대한 친숙도를 스스로 평가하도록 요청했습니다. 다음 10개의 질문을 통해 학생들은 분자 복제 기술(예: DNA 염기서열 분석, 제한 분해 반응, 아가로스 젤 전기영동)을 수행할 수 있는 능력을 스스로 평가할 수 있었습니다. 학생들은 또한 분자 클로닝 기술에 대한 지식을 바탕으로 분자 생물학 분야에서 경력을 쌓는 것이 편한지 여부를 보고했습니다. 학생들이 강좌 학습에 대한 자신의 헌신과 강좌가 가치 있는 학습 경험이었는지 스스로 평가할 수 있도록 사후 설문지에 두 개의 추가 질문이 포함되었습니다(보충 파일 6 및 보충 파일 7). 2022년 및 2023년 학생 사전 및 사후 설문지 응답의 모든 데이터는 분석을 위해 결합되었으며 보충 표 S1에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Homemade' MasterMix 성분</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>Homemade' MasterMix 성분</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 units</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 미생물 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 핵산 젤 염색</td><td>비오튬</td><td>NC9594719</td><td>10,000X</td></tr><tr><td>GeneJET 젤 추출 및 DNA 클린업 마이크로 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 applications</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora bacteria</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>전자레인지 오븐</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>분자 생물학 등급 아가로스</td><td>피셔 BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100g</td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0.05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 반응</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 벤치탑 오비탈 쉐이커</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Homemade' MasterMix 구성</td></tr><tr><td>요소 Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Homemade' MasterMix 구성 요소</td></tr><tr><td>휴대용 저울</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 벡터</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 반응</td></tr><tr><td>T5 엑소뉴클레아제</td><td>진원지</td><td>T5E4111K</td><td>Homemade' MasterMix 구성 요소</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Homemade' MasterMix 구성</td></tr><tr><td>요소 Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Homemade' MasterMix 구성 요소</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Homemade' MasterMix 구성 요소</td></tr></tbody></table>

adaptable molecular cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

improving-student-outcomes-with-an-adaptable-molecular-cloning-course

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

이 프로토콜의 목적은 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 EGFR 키나아제 단백질의 돌연변이를 활성화하기 때문에 발생하는 동적 구조적 변화를 검사하는 것입니다.

분자 역학 시뮬레이션을 통해 EGFR 체형 돌연변이를 활성화하는 구조적 효과 해독

배우세요 Gibson Assembly 기반 분자 클로닝 CURE 교육 모듈을 통해 학생들의 실험 이해도와 자신감을 향상시키는 방법. 자연산물 생합성 연구용 신규 플라스미드 클로닝 실습이 포함됩니다.

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

더 많은 동영상 탐색