off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

우리 팀은 열성 이영양성 표피박리증과 같은 현재 불치병의 심각한 피부 질환을 치료하기 위한 유도 만능 줄기 세포인 iPSC 요법을 개발하는 데 전념하고 있습니다. 우리는 iPSC의 피부 세포 분화와 결합된 정확한 유전자 편집이 이러한 질환에 대한 실행 가능한 치료 옵션을 제공할 수 있는지 확인하는 것을 목표로 합니다. CRISPR-Cas9 기술을 활용한 체세포 및 iPSC의 유전자 편집은 유전성 피부 질환을 포함한 다양한 질병에 대한 맞춤형 치료를 가능하게 함으로써 재생 의학을 변화시키고 있습니다.

유전 공학의 현재 과제에는 유전자 편집기의 off-target effect가 포함됩니다. 이 치료법은 게놈의 다른 위치를 변경하지 않고 관심 유전자를 정확하게 교정하는 유전자 편집기를 필요로 합니다. 우리의 과제는 유전자 편집자가 표적 유전자를 넘어 의도하지 않은 편집을 도입하지 않는다는 것을 입증하는 것입니다.

CIRCLE-seq 프로토콜을 사용하면 다른 유사한 기술이 놓칠 수 있는 실제 잠재적 off-target site를 식별할 수 있습니다. 이러한 off-target 부위에 대한 포괄적인 분석은 게놈 편집기의 활성에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 피부 질환에 대한 IPSC 기반 요법을 포함한 유전자 치료의 안전성을 향상시킵니다. 유도만능줄기세포를 5일간 배양한 후 원심분리로 세포를 채취하여 PBS 10ml에 재현탁시킵니다.

세포 계수를 위해 6마이크로리터의 트리판 블루에 6마이크로리터의 세포 현탁액을 혼합합니다. 계산 후 10을 두 번 곱하여 튜브당 7개의 세포의 거듭제곱을 합니다. 섭씨 25도에서 300G의 세포를 3분간 원심분리하고 상층액을 버립니다.

컨트롤 암을 원점으로 돌려 집속 초음파를 준비합니다. 물통을 정제된 탈이온수로 채웁니다. 제어 스테이션 랩톱에서 상수도에 액세스하고 채우기를 클릭하여 시스템 채우기를 시작합니다.

온도를 섭씨 4.5도로 조정합니다. 유도 만능 줄기 세포에서 분리한 25마이크로그램의 게놈 DNA를 마이크로튜브로 전달합니다. TE 버퍼로 튜브를 총 부피 130마이크로리터까지 채웁니다.

DNA를 평균 300 염기쌍 길이, 10초 지속, 피크 전력 70, 듀티 팩터 퍼센트 20, 사이클 버스트 50으로 전단 조건을 설정합니다. 전단된 게놈 DNA를 각각 65마이크로리터의 두 부분으로 나눕니다. XP 비드 부피의 1.8배를 사용하여 시료를 정제한 다음 마그네틱 랙을 분리합니다.

상층액을 새 PCR 플레이트로 옮기고 분광 광도계를 사용하여 DNA 양을 측정합니다. 마지막으로, 암시된 전단 게놈 DNA 1마이크로리터를 테이프 스테이션에 실행합니다. 먼저 oSQT1288과 헤어핀 어댑터를 TE 버퍼의 최종 농도인 100마이크로몰로 다시 현탁합니다.

어댑터 어닐링의 경우 40마이크로리터의 oSQT1288, 10마이크로리터의 10X STE 및 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 총 부피 100마이크로리터에 도달합니다. 어댑터 어닐링 후, 10 마이크로 리터의 5X ligation buffer, 5 마이크로 리터의 DNA ligase 및 5 마이크로 리터의 어닐링 된 hairpin adapter, 20 마이크로 리터의 어댑터 ligation master mix를 beads를 포함하는 각 용리 DNA 샘플에 혼합합니다. 샘플을 섭씨 20도의 온도에서 1시간 동안 열순환기에 넣은 다음 섭씨 4도에서 무기한 유지합니다.

다음으로, 50마이크로리터의 PEG/NaCl 스프레이 용액을 어댑터 결찰 DNA로 옮깁니다. XP 비드와 마그네틱 랙 분리를 사용하여 샘플을 정제합니다. 30마이크로리터의 TE 완충액 pH 8로 샘플을 용리하고 상등액을 새로운 semi-skirted PCR 플레이트로 디캔팅합니다.

샘플을 결합하고 dsDNA BR assay를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 순환화 마스터 믹스를 준비하려면 8마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물, 10마이크로리터의 10X TD4 DNA 리가제 완충액 및 2마이크로리터의 T4 DNA 리가제를 총 20마이크로리터의 부피로 결합합니다. 피펫: 20마이크로리터의 원형 마스터 혼합물을 사용자 PNK로 처리된 80마이크로리터의 500나노그램 DNA에 혼합합니다.

섭씨 16도의 열순환기에서 16시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음 날, 100마이크로리터의 XP 비드를 원형 DNA에 추가하고 앞에서 설명한 대로 샘플을 정제합니다. 38마이크로리터의 TE 완충액으로 샘플을 용리하고 상층액을 새로운 semi-skirted PCR 플레이트로 디캔팅합니다.

정제된 원형 게놈 DNA를 절단하려면 5마이크로리터의 10X Cas9 완충액, 4.5마이크로리터의 연쇄상구균 화농성 Cas9, 1.5마이크로리터의 게놈 RNA를 총 11마이크로리터의 부피로 결합하여 체외 절단 마스터 믹스를 준비합니다. cleavage 마스터 믹스를 실온에서 10분 동안 배양합니다. Cas9 gRNA RNP 복합체를 형성합니다.

125 나노그램의 플라스미드 안전 DNase 처리된 게놈 DNA를 뉴클레아제가 없는 물에서 39 마이크로리터의 최종 부피로 희석합니다. 그런 다음 11마이크로리터의 절단 마스터 믹스를 39마이크로리터의 DNA에 추가하여 총 50마이크로리터의 부피를 만듭니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 열순환기에 배양하고 무기한 섭씨 4도로 유지합니다.

배양 후 in vitro 절단 DNA에 50마이크로리터의 XP 비드를 추가하고 마그네틱 랙에서 DNA를 정제합니다. 정제된 DNA를 42마이크로리터의 TE 완충액으로 용리합니다. 차세대 염기서열분석 데이터를 분석하려면 Python 버전 2.7, Burrows-Wheeler Aligner 및 SAMtools를 설치하십시오.

해당 웹 사이트에서 참조 게놈을 다운로드합니다. 참조 게놈 FASTA 파일, 분석을 위한 출력 디렉터리, BWA 및 SAMtools 명령의 경로를 정의합니다. nuclease-cleaved 샘플과 control 샘플 모두에 대해 타겟 염기서열과 역다중화된 FASTQ 파일의 경로를 지정합니다.

다음 명령을 사용하여 표준 참조 기반 분석을 실행합니다. 전체 파이프라인을 실행할 때 해당 특정 단계에 대해 지정된 고유한 출력 폴더에서 각 단계의 출력 결과를 찾습니다.