Name: off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 CIRCLE-seq를 활용하여 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 off-target 절단 부위를 식별하는 방법을. 차세대 시퀀싱과 생물정보학 도구를 사용하여 유전자 치료의 안전성을 높이는 기술입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-Seq를 사용한 off-target CRISPR-Cas9 분할 이벤트 검출

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2-mL 얇은 벽 튜브와 플랫 캡</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>1.5% PippinHT 카세트</td><td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>150 x 25 mm 조직 배양 접시&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 시약 저장용기&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi 핫스타트 준비 믹스&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE 전기영동 버퍼&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 시약, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 마이크로 원심분리기&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>버퍼 QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 nuclease, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq 라이브러리 준비 및 NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354277</td> 세포<td>외 매트릭스(ECM) iPSC 배양을 위한</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix 프로브&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863010</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지 홀더&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 가스켓&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Droplet Generation Oil for probes로 제작&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>액적 리더 오일&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf에서 제작&nbsp; 써모믹서&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 순수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 I&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. 대장균</td></tr><tr><td>필터 유닛&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>필터링 멸균 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집속 초음파 발생기&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 분리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 전단</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 세포 코어 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td>gRNAs</td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Tri-gas Humidified Tissue Culture Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030411</td><td>iPSCs 배양 및 확장의 필요성 (37 &deg; C/5% CO2/5% O2)</td></tr><tr><td>고감도 D1000 DNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 시약</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>HTP 라이브러리 준비 키트&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 항생제 항진균제 용액</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8.0 (1x TE 용액)</td><td>통합 DNA 기술</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td></td><td></td><td>명시야 및 형광 채널에서 iPS 콜로니 이미징 필요</td></tr><tr><td>iPSC 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>람다 엑소뉴클레아제&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr><tr><td>로딩 팁, 10</td>팩 <td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate&nbsp;</td><td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Microtube AFA 섬유 사전 슬릿 스냅 캡&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x 보충제</td><td>StemCell 기술</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 기초 매체 (400 mL)</td><td>StemCell 기술</td><td>85851</td><td>배양에서 iPSC 유지를 위한 미디어</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000 분광광도계&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>Optical tube strip caps, 8x</td><td>strip Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Optical tube strips, 8x</td><td>strip Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Other Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Sealer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>모델 번호 PX1</td></tr><tr><td>PEG/NaCl SPRI 솔루션&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion 핫 스타트 플렉스 2x 마스터 믹스&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>피어싱 가능한 호일 히트 씰&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 안전 ATP 의존성 DNase&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>E3110K</td><td></td></tr><tr><td>Primers, Adapters and Probes</td><td>IDT</td><td></td><td>Sequences는 표 1</td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel 겔 분석 시스템&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA BR 어세이 키트&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA BR 어세이 키트&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA HS 어세이 키트&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 형광측정기&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 드롭릿 디지털 PCR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td>QX200 드롭릿 생성기와 QX200 드롭릿 리더</td></tr><tr><td>포함 RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Semi-skirted PCR Plate&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>SeqPlaque GTG 아가로스&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 안전 DNA 젤 염색&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75 플라스크&nbsp;</td>프로그래밍 가능한 온도 스테핑 기능이 있는 <td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR Plate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 웰, 반스커트, 녹색</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>사용자 효소&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 circle-seq

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

여기서, CIRCLE-seq는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분리된 DNA를 사용하여 아데노연관 바이러스 통합 부위 1(AAVS1)을 표적으로 하도록 설계된 gRNA가 있는 복합체에서 Cas9의 뉴클레아제 유도 절단 부위를 조사하는 데 사용됩니다. 이 gRNA는 이전에 본 출판물27에 설명되어 있습니다. 약 25μg의 gDNA를 iPSC에서 분리하고, 집속 초음파를 통해 전단하고, AMPure XP 비드 정제를 사용하여 크기를 선택하여 약 300bps의 단편을 생성했습니다. 이 25 μg의 DNA에서 약 2-5 ng의 DNA가 in vitro Cas9:gRNA 절단을 위해 성공적으로 순환되었습니다. 전체 절차는 그림 1에 나와 있습니다.
CIRCLE-seq 절차 및 계산 워크플로를 사용한 분석에 따라 감지된 모든 온-타겟 및 오프-타겟 분할 부위의 시각화가 그림 2A에 나와 있습니다. CIRCLE-seq 파이프라인은 또한 R 통계 소프트웨어를 통해 분석된 '병합 판독'을 제공하여 각 염색체를 따라 매핑된 검출된 뉴클레아제 유도 절단 부위를 보여주는 맨해튼 플롯을 생성했습니다(그림 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg"> 
그림 1: CIRCLE-seq 워크플로우 회로도. 프로토콜의 주요 단계가 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg"> 
그림 2: CIRCLE-seq 시각화 및 맨해튼 플롯. (A) AAVS1 유전자 자리에 대한 의도된 표적에 대한 비표적 부위의 정렬. 대상 시퀀스는 맨 위에 표시되며, 여기서 off-target은 읽기 횟수에 따라 내림차순으로 순위가 매겨집니다. 원래 타겟 염기서열의 차이는 착색된 뉴클레오티드로 표시됩니다. AAVS1 유전자 자리에 대한 상위 의도하지 않은 절단 부위의 샘플이 표시됩니다. (B) AAVS1 유전자 자리에 대해 감지된 의도하지 않은 절단 부위를 보여주는 맨해튼 플롯. 막대 높이는 각 염색체 위치에 대한 판독 횟수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>입문서</td>
			<td>시퀀스 (5'-3')</td>
			<td>코멘트/설명</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 단일 가이드 RNA (sgRNA)</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>AAVS1 Locus의 형광 단백질 knock-in용</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 포워드 프라이머</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATG</td>
			<td>gRNA in vitro cleavage 테스트용</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 리버스 프라이머</td>
			<td>아트씨씨그트그</td>
			<td>gRNA in vitro cleavage 테스트용</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>오SQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>CIRCLE-seq 헤어핀 어댑터</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>오SQT1274</td>
			<td>아아가타크가그카카가그</td>
			<td>트루시크 F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>오SQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>트루시크F2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>오SQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq 프로브</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>오SQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq 프로브</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: AAVS1 유전자 자리의 CIRCLE-seq 분석에 사용된 gRNA 및 primer의 염기서열.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 CIRCLE-seq를 활용하여 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 off-target 절단 부위를 식별하는 방법을. 차세대 시퀀싱과 생물정보학 도구를 사용하여 유전자 치료의 안전성을 높이는 기술입니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

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