Name: 식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 말라리아 기생충의 단백질 키나아제 보상 경로를 CRISPR-Cas9 유전자 편집으로 연구하는 방법입니다. 이 연구는 이중 키나아제 표적화가 약물 내성을 예방할 수 있음을 보여줍니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>말라리아 기생충에서 키나아제 재배선 식별: 화학 유전학 접근법

<table><tbody><tr><td>1x 인산염 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>안티 토끼 HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (세균 세포 펠릿화용)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (기생충 펠릿화/가공용)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (TX-400 로터)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td></td><td>NEB RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS 수용 세포</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a 수용 세포</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2cm gap</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP 화학발광 시약</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 염색 Himedia</td><td></td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 세파로스 4B</td><td>GE 헬스케어</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 유리산</td><td>머크</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>하이포잔틴</td><td>머크</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>인퓨전 HD 클로닝 키트</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, 탈인산화</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 젤 및 PCR 클린업 미니 키트</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA Polymerase</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep 스핀 미니프렙 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL 현장 지정 돌연변이 유발 키트</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Thiophosphate 에스테르 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

재조합 WT CDPK1은 N-말단 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그가 있는 융합 단백질로 발현되고 GST 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제됩니다. 정제된 CDPK1 단백질은 anti-CDPK1 및 anti-GST 항체를 사용하여 Western blot을 통해 검출되었습니다(그림 1). WT CDPK1의 트레오닌 게이트키퍼 잔기(T145)는 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 각각 CDPK1T145M 및 CDPK1T145S 돌연변이 재조합 단백질을 생성하는 Met 및 Ser로 대체되었습니다(그림 2). 모든 재조합 CDPK1 단백질의 키나아제 활성을 평가하기 위해 시험관 내 키나아제 분석을 수행했습니다. 키나아제 활성은 웨스턴 블롯 형식의 특정 항체를 사용하여 티오-포스페이트 에스테르 그룹을 검출함으로써 반합성 에피토프 태그 접근법34 를 사용하여 테스트되었습니다(그림 3). CDPK1의 자가인산화 활성과 CDPK1의 외인성 기질로 사용되는 MBP의 형질인산화에 대한 게이트키퍼 치환의 영향은 각각의 자가인산화 및 형질인산화 밴드의 강도를 정량화하여 평가되었습니다. 메티오닌 게이트키퍼가 있는 돌연변이 CDPK1은 ~53%의 트랜스인산화 활성을 유지한 반면, 게이트키퍼 위치에 세린이 존재하면 기질 트랜스인산화가 완전히 폐지되었습니다(그림 3). Thr에서 Met(T145M)로의 게이트키퍼 치환으로 이어지는 SNP는 2개의 플라스미드 시스템을 사용하여 CRISPR-Cas9를 통한 내인성 cdpk1 유전자좌에서 엔지니어링되었습니다(그림 4 및 그림 5). T145S 치환을 가진 돌연변이 기생충은 생성되지 않았는데, 이는 CDPK1 활성에 대한 Ser 게이트키퍼의 치명적인 영향 때문일 수 있습니다. CDPK1T145M 돌연변이 기생충은 제한 희석법을 사용하여 서브클로닝하고, CDPK1T145M 돌연변이 기생충의 생성을 검증하기 위해 Sanger 시퀀싱을 통해 게이트키퍼 치환을 확인했습니다. CDPK 계열의 7개 구성원과 기생충의 후기 분열성 발달에 관련된 4개의 다른 키나아제를 포함한 11개의 다른 키나아제의 전사체 수준을 Real-time PCR을 사용하여 테스트했습니다(그림 6). 11개의 서로 다른 키나아제의 발현 수준을 하우스키핑 유전자로 정규화된 CDPK1T145M 돌연변이 기생충과 야생형(WT) 기생충 간에 비교했습니다. CDPK 가족 구성원의 전사체 발현은 WT 기생충에 비해 CDPK1T145M 돌연변이에서 변경되었습니다(그림 6). CDPK1T145M 돌연변이에서 더 높은 발현을 보이는 전사체는 CDPK1T145M 돌연변이 기생충에서 CDPK1의 기능을 보상할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> 그림 1: 전장 재조합 야생형(WT) PfCDPK1의 특성화. N-말단 글루타티온 S 전이효소(GST) 태그와 융합된 전장 WT CDPK1 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하고 10% SDS-PAGE에서 분리했습니다. CDPK1은 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색 폴리아크릴아미드 겔에서 나타난 바와 같이 예측된 분자량 ~ 87 kDa로 이동했다. SDS-PAGE에서 분리한 재조합 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 항-CDPK1 및 항-GST 항체로 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리하였다. SDS-PAGE에서 전장 재조합 CDPK1에 해당하는 band를 두 항체 모두에서 검출하여 단백질의 정체를 확인하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> 그림 2: 정제된 재조합 CDPK1 게이트키퍼 돌연변이 단백질의 특성 분석. (A) TgCDPK1 및 PfCDPK1의 일차 아미노산 서열의 정렬(Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). PfCDPK1의 위치 145에 있는 트레오닌은 TgCDPK1의 게이트키퍼 위치인 글리신 128에 해당합니다(빨간색으로 강조 표시). (B) WT CDPK1에서 삼중항 코돈 ACC(검은색 원)로 인코딩된 Thr 게이트키퍼 잔류물(빨간색으로 강조 표시)의 만화가 표현. site-directed mutagenesis에 의한 gatekeeper 잔기를 대체하여 CDPKT145M에서 Met(노란색으로 강조 표시) 및 CDPKT145S에서 Ser(파란색으로 강조 표시)로 재조합 돌연변이 CDPK1 단백질을 생성합니다. (C) CDPK1의 재조합 WT 및 돌연변이 단백질의 SDS-PAGE 프로필. 재조합 WT 및 게이트키퍼 돌연변이 단백질을 GST 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에서 분리하였다. 모든 재조합 단백질은 ~87kDa의 예상 분자량을 따릅니다. M- 분자량 사다리. (D) 웨스턴 블로팅을 통한 재조합 CDPK1 WT 및 돌연변이 단백질의 특성 분석. CDPK1의 재조합 WT 및 게이트키퍼 돌연변이 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하고 웨스턴 블로팅을 위해 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. SDS-PAGE에서 full-length recombinant WT 및 mutant CDPK1 단백질에 해당하는 band를 anti-CDPK1 및 anti-GST 항체로 검출하여 모든 재조합 단백질의 동일성을 확인하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> 그림 3: CDPK1의 게이트키퍼 치환은 돌연변이 효소의 키나아제 활성을 감소시킵니다. (A) CDPK1 단백질의 키나아제 활성을 검출하기 위한 반합성 에피토프 태깅 접근법의 만화가 표현. 여기에는 transphosphorylation 활성만 설명되어 있습니다. CDPK1 단백질은 전달 가능한 말단 티오포스페이트기의 공급원인 ATPγS(노란색 실선 삼각형)가 있는 상태에서 외인성 기질(S, 단색 녹색 사각형)을 생성합니다. 티오포스포릴화된 잔기는 p-니트로벤질 메실레이트(PNBM)로 처리하여 알킬화되어 티오포스페이트 에스테르를 형성한 다음 알킬화된 티오포스페이트 부가물을 특이적으로 인식하는 항체로 검출됩니다. (B) 반합성 에피토프 태깅 접근법을 사용한 시험관 내 키나아제 활성 분석을 사용하여 재조합 CDPK1 돌연변이 단백질의 자가인산화 및 트랜스인산화 전위에 대한 게이트키퍼 치환의 효과를 테스트했습니다. 모든 재조합 단백질은 칼슘 의존성 키나아제 활성을 나타냅니다. CDPK1의 자가인산화(auto-phosphorylation) 및 외인성 기질인 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 트랜스인산화(trans-phosphorylation)는 염화칼슘(Ca2+)이 있는 경우에만 분명했으며, Ca2+ 이온의 특정 킬레이터인 EGTA의 존재 하에서는 인산화가 검출되지 않았습니다. 게이트키퍼 돌연변이는 감소된 자가인산화 활성을 보인 반면, MBP의 트랜스인산화는 CDPK1T145S년에 완전히 폐지되었습니다. CDPK1T145M는 이전에 보고된 바와 같이 트랜스인산화 전위(~ 53%)를 유지한다32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> 그림 4: CRISPR-Cas9를 사용하여 cdpk1 유전자좌의 게이트키퍼 위치에 SNP를 도입하기 위한 플라스미드 구성. 432 내지 451 bp에 해당하는 20개의 뉴클레오티드의 가이드 서열을 pL6eGFP 플라스미드의 BtgZI 제한 부위에서 클로닝하여 pL6CK1G를 생성하였다. 쉴드 돌연변이(빨간색으로 표시)와 함께 원하는 SNP(T145M 또는 T145S, 녹색으로 표시된 해당 코돈)를 통합한 상동성군(421 bp)을 AflII 및 SpeI 제한 효소 부위 내의 pL6CK1G에서 클로닝하여 각각 pL6CK1GT145M 및 pL6CK1GT145M을 생성했습니다. 쉴드 돌연변이는 원하는 편집 후 변형된 유전자좌의 재절단을 방지합니다. 두 번째 플라스미드에 인코딩된 Cas9 엔도뉴클레아제인 pUF1은 pL6CK1GT145M/S 플라스미드에서 발현된 guide RNA의 도움으로 cdpk1 유전자좌 내의 표적 부위로 전달됩니다. Cas9는 PAM 시퀀스의 5' 쪽을 향해 대상 부위에 이중 가닥 절단을 도입합니다. DSB는 pL6CK1GT145M/S 플라스미드의 homology arm을 사용하여 복구됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> 그림 5: P의 개략도 표현. cdpk1 유전자좌에서 게이트키퍼 돌연변이(T145M)의 도입을 위해 CRISPR 플라스미드를 사용한 falciparum transfection. i) 비동기 P. Falciparum 배양은 동기화된 고리 단계 기생충을 얻기 위해 소르비톨 처리됩니다. ii) 동기화된 고리 단계 기생충은 완충 용액에 재현탁된 pL6CK1G,T145M/S 및 pUF1 플라스미드와 함께 전기천공법 큐벳에서 채취합니다. iii) 기생충은 310볼트, 950μF 및 무한 저항에서 전기천공됩니다. iv) 형질주입 후, 기생충을 새로운 완전 RPMI 배지(cRPMI)가 포함된 T25 플라스크로 옮기고 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 형질주입된 기생충은 WR99210 및 DSM267 약물이 보충된 cRPMI로 전환되고 T75 플라스크에서 증식됩니다. v) 14일째에는 슬라이드를 준비하고 Giemsa 염색을 사용하여 염색합니다. vi) 그 후, 기생 적혈구의 존재를 평가하기 위해 광학 현미경으로 혈액 도말을 시각화합니다. vii) 시각화 시 기생충은 약물이 있는 상태에서 자랄 수 있습니다. 그 후, 기생충을 처리하여 표적 cdpk1 유전자좌의 원하는 변형을 검증하기 위한 PCR 및 DNA 시퀀싱을 위한 템플릿을 얻습니다. viii) 검증 후, 클론 형질전환 기생충은 96-웰 플레이트에서 제한 희석을 설정하여 수득합니다. ix) 양성 웰(positive well)로부터의 클론 형질전환 기생충을 T25 플라스크로 옮겨 성장시키십시오. x) 클론 형질전환 기생충은 PCR을 통해 추가로 검증되고 DNA 염기서열 분석 및 크로마토그램 분석을 통해 게이트키퍼 위치에서 원하는 SNP의 존재를 검증합니다. 그림은32에서 수정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> 그림 6: 실시간 PCR(RT-PCR)을 통한 표적 유전자의 전사체 분석에 사용되는 단계의 개략도. 나 는) P. 주로 성숙한 Schizont기 기생충이 있는 Falciparum 배양은 동일한 주기에서 소르비톨 처리를 통해 얻어집니다. ii) 기생충은 성숙한 분열기 기생충의 농축을 위해 15mL 원뿔형 튜브에 70/40 Percoll/sorbitol의 그래디언트에 부드럽게 층을 이룹니다. iii) 40 % 및 70 % personal/sorbitol의 간기에 있는 검은색 고리를 새로운 50mL 튜브로 옮기고 처리하여 cRPMI에 재현탁시킵니다. schizont-stage 농축 기생충은 침입을 위해 37 °C에서 사전 배양 된 신선한 RBC로 배양됩니다. iv) 기생충을 4시간 동안 배양한 다음 5% 소르비톨로 처리하여 고도로 동기화된 0-4시간 고리 단계 기생충을 얻습니다. v) 기생충을 추가로 배양하여 고도로 동기화된 44-48시간 분열기 기생충을 얻기 위해 소르비톨 후 추가로 처리한다. vi) 동기화된 기생충은 사포닌으로 처리하여 적혈구에서 방출하고 RNA 추출 시약에 저장합니다. 총 RNA는 RNA 추출 재현 기생충에서 분리됩니다. vii) cDNA는 분리된 RNA로부터 제조됩니다. viii) 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 타겟 유전자를 증폭하기 위해 cDNA 템플릿으로 Real-time PCR 실험을 설정합니다. 플레이트는 Real-Time PCR 시스템에서 실행됩니다. ix) 전사체 발현 데이터는 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 이 그래프는 CDPK1 T145M 기생충에서 야생형(WT)과 비교한 11개 키나아제의 차등 전사체 발현 수준을 나타냅니다. 이 수치는32에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>유전자 이름</td>
			<td colspan="4">프라이머 시퀀스</td>
		</tr><tr><td>PK1FPGex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>PK1RPGEX</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTTTTAGTAGTAGAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAaaaattttcttatcttcaaaaacatcaaac</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTTTTAGTAGTAG앗아가아아ttttatgaaggtggggaa</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAA아</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAaccgaattttatgaaggtgttttagagctagaa</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTA아</td>
		</tr><tr><td>CK1F1 </td>
			<td colspan="4">아팃쯔챠�</td>
		</tr><tr><td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCTCTCTG입니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 연구에 사용된 프라이머 목록.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>유전자 이름</td>
			<td colspan="2">포워드 프라이머</td>
			<td colspan="2">리버스 프라이머</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTTTTGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGT캇캣gt</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG 아캇캇쿵쿵�</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT 가얏트그타아</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATA아아타쿳쿳</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCcaatacatttgc</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">아그트크타아아아가타타 TAAAGAACTAGGTAG태그</td>
			<td colspan="2">챠타아아아아</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGT아</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA 아</td>
		</tr><tr><td>PKG (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">아</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGccatattg</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT 아싯캣카캣챗gtt</td>
		</tr><tr><td>갭드 (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">갸아아</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>표 2: Real-time PCR 분석에 사용된 프라이머의 염기서열과 함께 표적 유전자 목록(PlasmoDB 식별 번호).

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.

리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

배우세요 말라리아 기생충의 단백질 키나아제 보상 경로를 CRISPR-Cas9 유전자 편집으로 연구하는 방법입니다. 이 연구는 이중 키나아제 표적화가 약물 내성을 예방할 수 있음을 보여줍니다.

식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

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