Name: 단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 NMR 15N 이완 실험을 통해 단백질의 피코초에서 나노초까지 구조 역학을 분석하는 방법을. 이 기법은 고유 불구조 단백질의 잔기별 동역학을 연구하여 분자 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>단백질 역학 연구에서 NMR 15N 이완 및 hetNOE 실험을 위한 프로토콜

이 프로토콜은 Lakomek et al.69 및 Stief et al.70에 의한 NMR 15N 이완 실험의 설정을 설명했습니다. 우리는 감도가 향상된 HSQC 검출 체계를 사용하여 NMR 펄스 시퀀스에 중점을 두었습니다. 15NR1 및R1ρ 실험은 Stief et al.70에 의해 상세히 기술된 바와 같이 구현되고, hetNOE 실험은 Lakomek et al.69에 의해 설명된다.
NMR 이완 실험을 설정할 때 너무 긴 최대 이완 기간을 선택하거나 스핀 잠금의 너무 높은 RF 진폭을 선택하면 프로브가 손상될 수 있으므로 15NR1ρ가 가장 중요합니다. 이완 기간의 경우, 전체 감쇠 곡선을 100% 강도에서 25% 강도(참조 실험과 비교)까지 동일하게 샘플링하는 것이 바람직합니다. IDP와 같이 천천히 이완되는 단백질의 경우, 15N T의긴 2 배, 프로브로의 전력 증착을 제한해야 하기 때문에 붕괴 곡선을 전체 범위까지 샘플링하는 것이 저렴하지 않은 경우가 많습니다.
15N무선 주파수(RF) 진폭의 경우 이론적으로 RF 진폭 ν스핀 잠금이 높을수록 더 많은 교환 프로세스에 다시 초점을 맞출 수 있으므로 더 좋습니다. 일반적으로 1 / (2π νspin-lock)보다 느린 교환 프로세스는 다시 초점을 맞출 수 있습니다. 그러나 RF 전력 제한이 적용됩니다. 예를 들어, 우리 손에서는 안전 쪽을 유지하기 위해 65kHz의 RF 진폭이 적용될 때 2ms의 최대 스핀 잠금 기간을 초과하지 않을 것입니다. 동시에 600MHz 분광계에서 스핀 록 RF 진폭은 1kHz(예: 600MHz에서 1.4kHz)보다 높아야 하며, 이는 작은 구상 단백질 gb369에 충분한 것으로 입증되었습니다. 스펙트럼 폭을 커버하고 더 높은 전계 강도에서 오프 공진 효과를 피하기 위해 해당 RF 진폭은 자기장에 따라 조정되어야 합니다(예: 900MHz(ν스핀 잠금<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2kHz)에서 1.5배 더 높음). 그러나 프로브의 한계 내에 있어야 합니다. (분광계 전력 제한의 현지 목록을 참조하고 NMR 시설 관리자에게 조언을 구하십시오.) 
참조 실험(shorted delay)과 가장 긴 지연 기간(위에서 논의한 요인에 의해 결정됨) 사이의 relaxation delays의 간격을 선택하기 위해 relaxation delay 데이터 포인트의 동일한 간격을 선호하고 8 숫자를 선택합니다(할당된 측정 시간 및 신호 대 잡음이 허용되는 경우). 첫 번째 증가(및 후속 증가)는 가장 강렬한(그리고 종종 가장 느리게 이완되는) 잔류물에 의해 지배될 것입니다. 따라서, 단백질의 동적 범위에 따라, 단백질 서열에 있는 여러 잔기의 NMR 신호는 선택된 최대 이완 기간 후에 이미 붕괴되었을 수 있다. 지연점을 균등하게 간격을 둠으로써, 빠르게 이완 잔차의 이완 곡선이 이완 곡선을 샘플링하는 충분한 수의 데이터 포인트에 의해 커버되도록 합니다.
또한 정확한 이완 데이터를 얻고 프로브의 장기적인 손상을 방지하기 위해 복구 지연을 적절하게 선택하는 것이 중요합니다. 프로브의 손상을 방지하기 위해 최소 D1 = 2 초의 복구 지연을 선택합니다. 정확한 결과를 얻기 위해서는 단백질 1H 및 15N 세로 분극에 평형 상태로 돌아가거나 최소한 안정적이고 안정된 상태로 돌아갈 수 있는 충분한 시간이 주어져야 합니다. 1H T1 은 일반적으로 중소형 단백질 (최대 20kDa)의 경우 600MHz에서 1 초와 4 초 사이로 다양합니다. 더 큰 단백질과 더 높은 분야의 경우 1H T1 이 더 증가합니다. 작은 구상 단백질 gb3의 경우 D1 = 3.5 s가 15N R1 및 R1ρ 실험에 충분하다는 것을 발견했습니다. 이 프로토콜에 제시된 작은 IDP Syb-2의 경우 최근에 D1 = 2 s가70으로 적절하다는 것을 보여주었습니다.
15N hetNOE는 여기가 15N에서 시작되고 펄스 시퀀스 시작 시 1 H-15N INEPT가 적용되지 않기 때문에 감도가 가장 낮습니다. 또한, 정확한 데이터를 얻기 위해서는 1H포화 구간 및 15N회복 지연이 5 x 15NT1이어야 한다. 여기에 제시된 IDP Syb-2의 경우, 5초의 포화/회복 지연과 추가적인 2초의 D1 회복 지연(총 7초)으로 충분했지만, 더 큰 단백질 및/또는 중수소화 단백질의 경우, 이 시간은 실질적으로 더 길어질 수 있습니다(예: 10초 이상). 그러나 정성적 데이터가 충분히 양호한 경우 약간의 체계적 오프셋이 허용될 수 있습니다. 이 경우, 포화도의 95%가 달성될 것이기 때문에, 이미 3배 15NT1에서 합리적인 결과를 얻을 수 있다. 이 경우 결과 hetNOE 값은 더 높은 값에 대한 체계적인 오프셋을 표시합니다.
이 프로토콜에서는 가장 비용 효율적인 완전 양성자 15NSyb-2로 작업했습니다. Side-chain deuteration은 이완 경로의 수를 줄이고 가장 고립된 1 H-15N 백본 아미드 스핀 쌍과 함께 작업하기 위해 권장됩니다. 그러나, 15N2H Syb-2 및 15N syb-2를 비교하면, 중수소화 및 완전 양성자 샘플 사이에 차이가 거의 없음을 알 수 있다(70). 실용적인 목적을 위해, NMR 이완 데이터는 이중 또는 삼중 표지 샘플(15N13C 또는 2H15N13C)에 자주 기록됩니다. 논의된 NMR 펄스 서열은 13°C와 1H또는 15N핵 사이의 J 커플링 진화를 재집중시킬 수 있습니다. 분명히, 13C 라벨링이 도입될 때 이완 경로도 증가할 것입니다. 그러나 실용적인 목적을 위해 도입된 오류는 5% 미만이며 정성적 데이터만 필요한 경우 허용될 수 있습니다.
검출을 위해 다양한 크기의 단백질을 작업할 때, 감도가 향상된 HSQC 검출 실험(70 ) 또는 TROSY 검출 실험(69)을 선택할 것인지에 대한 질문이 자주 있습니다. 작은 단백질의 경우 감도가 향상된 HSQC 검출 NMR 실험은 신호 대 잡음비에서 2배의 이득을 제공합니다(우수한 수분 억제를 얻을 수 있는 경우). 더 큰 단백질의 경우 TROSY로 검출된 실험이 성공할 것입니다. 손익분기점은 접힌 단백질의 경우 대략 20kDa입니다. 사슬 길이가 증가함에 따라 대략 선형적으로 증가하는 낮은 R2 속도 상수를 얻을 수 있는 IDP의 경우 손익분기점을 더 높은 분자량으로 이동할 수 있습니다. 실용적인 목적을 위해, 의심스러울 경우 감도 향상 HSQC 검출 또는 TROSY 검출 실험을 모두 구현하는 것이 좋습니다. 그런 다음 첫 번째 증분에서 최상의 신호 대 잡음비를 제공하는 것을 선택하십시오.
감도 향상 HSQC 검출 또는 TROSY 검출 실험을 선택할지 여부에 대한 논의는 신호 대 잡음비가 주요 기준인 경우에만 적용됩니다. 가장 작은 선 너비와 가장 높은 해상도가 필요한 경우 TROSY가 항상 승리합니다. TROSY는 또한 더 적은 수의 양성자 펄스와 양성자 디커플링이 필요하지 않기 때문에 항상 최상의 수분 억제를 제공합니다. 보다 자세한 논의를 위해 이전에 발표된 기사69 를 참조합니다.
물 억제 문제에 대해 한 가지 더 언급하십시오. Bruker Avance NEO 콘솔에서는 수신기 게인(rg)을 16으로 설정하는 것으로 충분할 수 있지만 일반적으로 (구형) Bruker Avance 콘솔에는 128-256 범위의 수신기 게인이 바람직합니다. 달성 가능한 rg(Bruker 명령 rga에 의해 결정됨)는 잔류 물 신호의 강도에서 소음 수준까지 자주 얻어집니다. 수분 억제 불량은 항상 스펙트럼에 추가 노이즈를 유발합니다. 따라서 Bruker Avance NEO 콘솔에서 rg = 16을 달성할 수 있더라도 남아 있는 물 신호는 소음 수준에 크게 기여할 수 있습니다. 따라서 신호 대 잡음비가 감소합니다. 따라서 128-256의 rg 레벨을 목표로 하는 것이 좋습니다. 제시된 펄스 시퀀스(70 )는 600MHz 및 1200MHz에서 테스트되었습니다. 두 전계 강도는 펄스 시퀀스에 기록된 것과 동일한 그래디언트 설정에서 작동합니다. 적어도 추가 최적화를 위한 좋은 시작점으로 권장됩니다.
서론에서 언급했듯이 논의된 NMR 완화 실험은 피코초에서 나노초 시간 범위만 다룹니다. 마이크로초에서 밀리초 동역학에 대한 통찰력을 얻기 위해 이완 분산 실험, CPMG 실험을 참조하고, 스핀 잠금 진폭(또는 캐리어 주파수)을 변경하는 R1ρ 실험의 확장이 사용됩니다(44,46,58,59,60,61,85,86). 마이크로초보다 느린 역학은 15N CEST(화학 교환 포화 전달) NMR62, 교환 분광법(EXSY, 밀리초에서 초) 또는 RT(실시간) NMR(초에서 시간)63,64로 캡처할 수 있습니다. 잔류 쌍극자 커플링(RDC)뿐만 아니라 상자성 프로브의 PRE(상자성 이완 향상) 효과는 ps에서 ms 역학 65,66,67,68까지의 전체 범위를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
이 모든 실험은 백본 동역학만 다룹니다. 곁사슬 역학을 조사하기 위해 Kay와 동료들은 최대 1 MDa 2,87의 단백질에 대한 곁사슬 역학에 대한 정보를 제공하는 또 다른 과다한 NMR 실험을 도입했습니다.
단백질 골격 역학에 대한 보다 정량적인 통찰력을 얻으려면 세 가지 NMR 매개변수인 15NR1, R2 및 hetNOE를 모두 결합한 분석이 필요하며, 때로는 상호 상관 이완 속도 상수와 같은 추가 매개변수가 포함되기도 합니다. 다양하고 정교한 분석 방법이 개발되었습니다. 소위 모델 없는 접근법은 생체 분자 NMR 43,88,89,90,91에 널리 적용되었습니다. 또한, 스펙트럼 밀도 매핑은 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다(55,92,93). 이는 회전 상관 시간이 잘 정의된 구형 단백질에 대한 강력한 분석 방법이지만, IDP에 대한 적용 가능성은 제한적입니다. 접힌 영역은 회전 상관 시간(39)을 정의하기 위해 필요합니다. 관련된 서로 다른 시간 척도가 잘 분리될 수 있는 경우 상관 함수 C(t)를 지수적으로 감소하는 함수의 합으로 모델링할 수 있을 때 이것은 부분적으로 우회할 수 있습니다 23,31,84. 잘 정의된 회전 상관 시간이 없는 경우, 상관 시간의 분포를 포함하는 대안적인 접근법, 예를 들어, IMPACT 분석(94) 또는 DETECTOR 분석(95,96)이 대안이다. 또한, NMR 완화 데이터와 MD 시뮬레이션의 결합 분석도IDPs 97에게 유망합니다. 현재, 우리는 여전히 더 큰 IDP31,98의 전체 원자 시뮬레이션에 대한 샘플링 및 힘-필드 제한에 직면해 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Bruker 600 MHz AVANCE III HD 분광계&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>NMR 실험 수행&nbsp;</td></tr></tbody></table>

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 nmr 15n 이완 실험

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

연구

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생화학

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