Name: 설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 설치류 심장 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하는 방법을. 고해상도 호흡측정법과 호흡조절비율로 품질을 평가하여 질병 메커니즘 연구와 새로운 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>고품질 생체 에너지 연구를 위한 설치류의 미토콘드리아 분리

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 유리 비커</td><td></td><td></td><td>장기 절개 및 민싱용</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>원심분리</td></tr><tr><td>아데노신 5'-디포스페이트 모노포타슘 염 이수화물</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>호흡량 측정 분석</td></tr><tr><td>BSA 단백질 분석 키트</td><td>열 향</td><td>PI23225</td><td>미토콘드리아 단백질 정량화</td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>버퍼 (CB)</td></tr> <tr><td>에틸렌 글리콜 - 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>E4378</td><td>완충액 (CB 및 IB) 및 호흡량 측정 분석</td></tr><tr><td>: 유리 캐뉼라</td>, <td>Radnoti,</td><td></td><td>기니, 돼지 및 쥐 심장 관류</td></tr>, <tr><td>헤파린, 나트륨, 돼지 점막,</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU</td><td>동물 IP 주입</td></tr><tr><td>고해상도 호흡계</td><td></td><td></td><td>클라크형 전극; 2 mL 챔버가 있는 옥시그래프</td></tr><tr><td>유도 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>시그마&nbsp;</td><td>792632</td><td>마취제&nbsp;</td></tr><tr><td>L-말산</td><td>시그마&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>호흡량 분석</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마&nbsp;</td><td>M9272</td><td>버퍼(RB)</td></tr><tr><td>만니톨</td><td>시그마&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>버퍼 (IB)</td></tr> <tr><td>마이크로 리터 주사기</td><td></td><td></td>의 <td>경우 크기는 5&ndash; 50 &마이크로; L</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td>는 37°C에서 배양할 수 있어야 합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>걸레</td><td>시그마&nbsp;</td><td>475898</td><td>모든 버퍼</td></tr><tr><td>O2 탱크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMNI THQ 균질화기</td><td>OMNI International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>유사한 로터 스테이터 균질화기는 피펫을 작동시킬 것입니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td> 볼륨<td>&nbsp; 2&ndash; 20 & 마이크로; L; 20&ndash; 200 &마이크로; L; 200&ndash; 1000 &마이크로; L</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마&nbsp;</td><td>P3911</td><td>완충액 (RB 및 CB)</td></tr> <tr><td>인산 칼륨 이염기성</td><td>시그마&nbsp;</td><td>795496</td><td>완충액(IB 및 RB)</td></tr><tr><td>의 경우 Bacillus licheniformis Sigma의 프로테아제</td><td>&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S9888</td><td>완충액 (CB)</td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>피셔 생물시약</td><td>BP356-100</td><td>호흡량 측정 분석</td></tr><tr><td>자당 시</td><td>그마&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>완충액 (IB)</td></tr><tr><td>용 외과적 해부 키트</td><td></td><td></td><td>동물 및 조직 출처에 따라 다름</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td></td><td></td><td>4°C로 냉각해야 합니다. 씨&nbsp;</td></tr></tbody></table>

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

미토콘드리아 분리가 완료되면 고분해능 호흡 측정법을 사용하여 산소 소비량(JO2)을 정량화하여 분리체의 품질과 기능을 테스트해야 합니다. 이를 위해 미토콘드리아 스톡을 40mg/mL로 희석하여 분리된 심장 미토콘드리아를 사용하는 모든 호흡 측정 분석에 대해 RB 2mL에 0.1mg/mL의 작업 농도를 허용했습니다. 호흡은 칼슘 킬레이트제인 1mM EGTA의 존재 하에 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트에 의해 연료를 공급하고, 상태 2 호흡을 확립하기 위해 5분 동안 평형을 이루도록 허용했습니다. 이 상태에서 산소 소비량은 평균 45-55pmol/mL/s 또는 27-33nmol/mg/min이어야 합니다. 전극에 따른 산소 소비율을 인식하고 필요한 경우 적절한 배경 보정을 수행하십시오. 산화적 인산화(상태 3)는 500μM ADP의 볼루스에 의해 5분 표시에서 시작됩니다. 기판 추가 및 대표 추적은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. 기능성 미토콘드리아는 그림 2와 같이 조직 소스에 따라 범위가 넓은 ADP를 추가한 후 JO2가 즉시 증가합니다. EGTA를 사용하지 않는 경우, 잔류 칼슘은 미토콘드리아 농도, 기질 가용성 및 기타 환경 요인에 따라 OXPHOS 중 JO2의 최대 속도에 다양한 영향을 미칩니다. 완충액 조성은 미토콘드리아 막의 무결성과 기능성을 보존하는 데 중요합니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 언급된 모든 완충액 레시피는 표 1에 더 상세히 설명되어 있으며, 본원에 설명된 모든 미토콘드리아 제제에 활용될 수 있다.
미토콘드리아의 성공적인 분리는 표 2와 같이 각 종 및 조직 소스에 대해 주어진 범위 내에 있는 RCR 값을 얻는 것으로 표시됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 수집된 데이터를 기반으로 기니피그, 랫트 또는 마우스에서 심장 미토콘드리아를 분리하는 경우 RCR은 각각 ≥16, ≥8 및 ≥5여야 합니다. 쥐의 간 또는 신장에서 분리하는 경우 RCR은 ≥6이어야 하며, 세포의 RCR은 3.8 이상이면 허용되는 것으로 간주됩니다. RCR 값이 이 범위 아래로 떨어지거나 호흡 측정 추적에 질적 차이가 있는 경우 오염 문제를 배제하기 위해 새로운 RB 및 기질을 사용한 추가 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 1-1/RCR 변환은 0과 1 사이의 값을 제한하지만 RCR 값이 10보다 클 때 성별 또는 종 간의 미토콘드리아 품질을 비교할 때 이 메트릭은 권장되지 않습니다. 이러한 이유로 모든 실험에서 표준 RCR 값(State 3/State 2 또는 OXPHOS/LEAK)을 정량화했습니다. 마우스의 심장, 간, 신장 및 세포에서 미토콘드리아를 더 잘 분리하기 위해 이 프로토콜에 대해 수행할 수 있는 조절에 관한 정보는 표 3에 자세히 설명되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> 그림 1: 고분해능 호흡 측정법을 사용한 품질 관리 검사를 위한 관심 영역. 호흡 챔버에 2mL의 RB를 로드하고 산소 소비율이 0에 가까워질 때까지 37°C에서 평형을 이루도록 했습니다. 평형이 이루어지면 칼슘 킬레이트제인 1mM EGTA를 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트와 함께 첨가했습니다. 이러한 기질을 첨가한 후, 미토콘드리아를 원하는 작업 농도(0.1mg/mL)로 첨가하고 상태 2 호흡(노란색)을 달성하기 위해 5분 동안 호흡하도록 했습니다. 5분 표시에서 500μM ADP를 추가하여 상태 3 호흡(빨간색)을 시작했습니다. RCR은 상태 3과 상태 2를 비교하기 위해 빨간색과 노란색 상자로 표시된 산소 소비량의 평균을 기준으로 결정되었습니다. 상태 4는 녹색 상자로 표시되며 ATP의 미토콘드리아 외 ATPase 가수분해 기간을 나타내며 시토크롬 C 분석에서 외막 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 표시된 데이터는 SD 쥐 심장 미토콘드리아를 사용하여 수집되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> 그림 2: 동물 및 조직 공급원에 대한 대표적인 JO2 추적 및 호흡 제어 비율. 분리된 미토콘드리아의 품질은 고해상도 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모량을 정량화하여 테스트했습니다. 호흡은 1mM EGTA가 있는 상태에서 5mM 피루브산나트륨 및 1mM L-말레이트에 의해 연료를 공급했습니다. 미토콘드리아와 기질은 상태 2 호흡이 안정화되도록 5분 동안 호흡하도록 했습니다. ADP 추가 후 최대 산소 소비량을 ADP 이전 State 2 산소 소비량과 비교하여 각 조직에 대한 호흡 제어 비율(RCR)을 계산했습니다. 미토콘드리아 품질은 P-L 제어 효율 표준에 의해 특성화된 1-1/RCR 값을 계산하여 추가로 평가했습니다. 각 추적의 오른쪽에 있는 막대 그래프는 주어진 조직에 대한 수(파란색) 및 암(녹색) 평균 RCR 및 1-1/RCR 값± SD를 나타냅니다. (A), (B) 및 (C)는 각각 기니피그, Sprague Dawley(SD) 쥐 및 Friend 백혈병 바이러스 B(FVB) 쥐의 심장을 사용하여 수집된 데이터를 나타냅니다. (D)와 (E)는 SD 쥐의 간과 신장에서 채취한 결과이며, (F)는 HEK293 세포를 나타냅니다. 3개의 큰 간엽을 채취하고 양쪽 신장을 분리하는 데 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 버퍼 레시피. 격리 과정 전반에 걸쳐 사용되는 심정지 완충액(CB), 격리 완충액(IB) 및 호흡 완충액(RB)은 나열된 지침에 따라 미리 준비해야 합니다. CB는 4°C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있는 반면, IB와 RB는 -80°C에서 4개월 동안 보관할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 호흡 조절 비율 분석. 기능 분석을 위한 미토콘드리아 분리는 HEK293 세포뿐만 아니라 남성 및 여성 설치류의 광범위한 종 및 조직 소스에 걸쳐 수행되었습니다. 각 성별, 조직 출처 및 종의 표본 크기는 평균 RCR 및 SD± 1-1/RCR 값과 함께 자세히 설명되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 단백질 수율을 높이기 위해 서로 다른 조직에 대한 미토콘드리아 분리 프로토콜에 대한 권장 조절. 프로테아제 및 원심분리 량의 변화는 조직 공급원에 따라 표시됩니다. 총 단백질(mg)의 평균 양은 BSA 단백질 분석의 결과와 최종 미토콘드리아 펠릿의 재현탁 부피로부터 계산되었습니다. 값은 SD의 평균± 보고됩니다. 원심분리 컬럼에 포함된 굵은 글씨체의 지침은 상층액을 폐기, 보유 또는 합산할지 여부를 알려줍니다. 폐기는 생물학적 폐기물 용기에 상층액을 처분하는 것을 의미하며, 보유 및 풀링은 각각 상층액을 다음 원심분리 튜브로 옮기거나 최종 스핀을 위해 수집하는 것을 말합니다. 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에서 확인할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

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Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

배우세요 설치류 심장 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하는 방법을. 고해상도 호흡측정법과 호흡조절비율로 품질을 평가하여 질병 메커니즘 연구와 새로운 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리

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