Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

우리의 연구는 공기 액체 계면에서 정상적인 인간 기관지 상피 세포를 구별하여 얻을 수 있는 가성층 기도 상피의 두 가지 중요한 생물물리학적 특성을 측정하는 것을 목표로 합니다. 우리는 가성층화된 기도 상피를 사용하여 다양한 호흡기 바이러스의 다양한 특징을 식별했습니다. 예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 주도 세포골격계 염증이 있는데, 이는 세기관지염의 비표준 기전입니다.

우리는 또한 배상세포 증식이 만성 폐쇄성 폐질환 기도 상피에서 SARS-CoV-2 복제를 증가시키는 것을 확인했습니다. 우리는 RSV 감염 및 바이러스 유발 세기관지염을 퇴치하기 위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 세포골격 신호의 호흡기 세포융합 바이러스 주도 조절의 메커니즘을 밝히는 데 중점을 두었습니다. 먼저 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포 현탁액을 예로 들어 보겠습니다.

P200 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 완전 기도 상피 세포 또는 AEC 배지에 50, 000개의 재현탁 세포를 삽입물의 정점 쪽에 추가합니다. 섭씨 37도에서 85%에서 95%까지 가습된 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 세포가 합류하면 멸균 집게를 사용하여 삽입물을 빈 우물로 옮깁니다.

P1000 피펫을 사용하여 모든 기초 AEC 매체를 흡입합니다. 그런 다음 2%페니실린-스트렙토마이신과 1%암포테리신 B가 보충된 500마이크로리터의 새로운 완전 ALI 분화 배지를 기저 웰에 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 완전한 ALI 배지를 추가한 상태로 삽입물을 기저 웰로 옮깁니다.

P200 피펫을 사용하여 웰에서 정점 AEC 매체를 부드럽게 흡인하고 배양합니다. 48시간 후, 멸균 집게를 사용하여 삽입물을 빈 웰로 옮깁니다. P1000 피펫을 사용하여 기존 배지를 흡입하고 500마이크로리터의 새로운 완전 ALI 배지를 추가합니다.

멸균 집게를 사용하여 새 배지로 인서트를 웰에 다시 놓습니다. 26일째에 P200 피펫을 사용하여 인서트의 정점 면에 100마이크로리터의 DPBS를 추가합니다. 섭씨 37도의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 P200 파이펫을 사용하여 DPBS를 흡입합니다. 시작하려면 현미경, 연결된 컴퓨터 및 환경 챔버를 켭니다. 챔버 도어를 열고 NBHE 셀이 있는 인서트가 들어 있는 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다.

접시가 무대에 오르면 챔버를 닫습니다. 그런 다음 현미경 스테이지 작동 손잡이를 사용하여 플레이트를 이동하고 인서트를 시야에 가져옵니다. 컴퓨터 화면에서 SAVA 시스템 아이콘을 클릭하여 SAVA 프로그램을 엽니다.

소프트웨어 인터페이스에서 Configure Experiment를 클릭합니다. 다음 탭에서 Create Experiment(실험 만들기)를 클릭합니다. 그런 다음 새 탭에서 데이터가 저장될 디렉토리를 Enter Experiment Directory Name 필드에 입력하고 Enter Experiment Description 필드에 세부 정보를 제공한 다음 OK를 클릭합니다. 이제 생성되어 Experiments(실험) 섹션 아래의 디렉토리에 표시된 실험을 클릭합니다.

그런 다음 Modify(수정)를 클릭하고 Sample Description(샘플 설명) 필드에 샘플 세부 정보를 제공합니다. Add(추가)를 클릭한 다음 Exit(종료)를 클릭하여 탭을 종료합니다. 기본 소프트웨어 인터페이스의 Experiment 슬롯에 있는 드롭다운 메뉴에서 생성된 실험을 선택합니다.

그런 다음 비디오 녹화를 클릭하여 컴퓨터 화면에서 섬모 비트 주파수를 모니터링합니다. 화면에 집중된 섬모 움직임이 표시됩니다. 각 삽입에 대해 초당 120프레임으로 2.1초 동안 6개의 서로 다른 임의 필드를 기록합니다.

Save Video(비디오 저장)를 클릭하여 섬모 비트 주파수 데이터를 모니터링합니다. 데이터를 분석하려면 소프트웨어 인터페이스에서 비디오 분석을 클릭하십시오. 다음 탭에서 확인을 클릭합니다. 그런 다음 다음 탭으로 이동하여 모두 분석을 클릭하십시오.

컴퓨터의 SAVA Data Acquisition 폴더에서 각 실험에 대해 생성된 스프레드시트를 다운로드합니다. 데이터 표현을 위한 가우스 평균 빈도를 사용합니다. 섬모 박동 주파수는 건강한 성인과 COPD 환자의 기도 상피 모두에서 최소 3Hz에 도달하여 유사한 섬모 기능을 보여주었습니다.

시작하려면 전원 스위치를 사용하여 EVOM2 전압 저항계를 켭니다. 테스트 저항을 입력 슬롯의 EVOM2에 연결합니다. EVOM2 화면에서 판독값을 모니터링합니다.

판독값이 1, 000보다 높거나 낮으면 장치를 보정하기 위해 균일한 2, 1 판독값이 표시될 때까지 집게를 사용하여 EVOM000의 ADJ 스위치를 돌립니다. 이제 실험 제어 판독을 위해 빈 삽입을 가져옵니다. P200 피펫을 사용하여 빈 인서트의 정점 면에 100마이크로리터의 DPBS를 추가합니다.

그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 기저 쪽에 500마이크로리터의 DPBS를 추가합니다. 그런 다음 테스트 저항을 분리하고 STX2 전극을 EVOM2의 입력 슬롯에 연결합니다. 그런 다음 2% 에탄올로 STX70 전극을 부드럽게 청소합니다.

DPBS로 STX2 전극을 빈 인서트에 삽입하고 짧은 전극 다리는 정점 부분에, 긴 전극 다리는 기저 부분에 유지합니다. 이제 EVOM2 화면에 안정적인 판독값을 기록합니다. 그런 다음 P200 피펫을 사용하여 인서트의 정점 면에 100마이크로리터의 DPBS를 추가합니다.

앞서 표시된 것처럼 26일 분화 기도 상피가 있는 삽입물에 STX2 전극을 삽입합니다. 그런 다음 EVOM2 화면에 안정적인 판독값을 기록합니다. COPD가 있는 성인에서 경상피 전기 저항 값이 증가하여 COPD의 막 불투과성이 향상되었음을 나타냅니다.