Name: In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 CD34+ 조혈 줄기세포의 체외 적혈구 분화 방법을. FACS와 유전자 변형 기술을 활용하여 골수형성이상증후군 관련 빈혈 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>제대혈 및 골수의 HSPC를 사용한 적혈구 모델링

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>비드</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE 항체</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운팅 매체&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACS리아 퓨전&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr>, <tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr>, <tr><td>젤라틴</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 솔루션</td>, <td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES,</td><td>Merck</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>인간 EPO</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>인간 Flt-3 리간드</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>인간 G-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>인간 IGF1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-6</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>인간 SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>인간 TPO</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald 해결책&nbsp;</td><td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 고처리량 스캐너&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>써모 사이언티픽</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>줄기세포 배지 배지</td><td>줄기세포 기술</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

제대혈 또는 골수에서 추출한 CD34+ 세포를 먼저 해동하고 자극한 후 GFP 발현 shRNA로 형질주입합니다(그림 1A). CD34+GFP+ 세포는 그림 1B에 예시된 게이팅 전략에 따라 형질도입 후 4일 후에 분류됩니다. 대표적인 결과는 transduction 및 FACS 분류 후 CD34+ 세포의 성숙을 보여주었습니다. 세포는 (1) CD71 / CD235a 9,10,11 염색을 사용하여 여러 성숙 단계에서 유세포 분석으로 분석됩니다 (그림 1A). (2) 현미경으로 시각화한 Giemsa 염색에 따른 면역화학에 의해.</p...

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

a-comprehensive-pipeline-to-assess-efficiency-human-erythropoiesis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의​​ 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

우리는 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계를 해부 체외 마우스 태아 간 erythroblast 문화 시스템을 제시한다. 이 시스템은 서로 다른 개발 단계에서 특정 유전자의 기능 분석을 용이하게한다.

마우스 태아 간 문화 시스템은 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계에서 대상 유전자의 기능을 해부하기

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

여기 선물이 레드 셀 deformability 및 세포질이 ektacytometry에 의해 측정 하는 기법. 이러한 기술은 붉은 세포 deformability의 일반적인 조사 및 혈액 질병 낫 세포 빈 혈 등 혈액 순환에 견고 하 고 변형 세포의 존재에 의해 특징의 특정 조사에 적용 됩니다.

Deformability 및 Ektacytometry에 의해 혈액이 질 레드 셀 측정

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

학습하세요 CD34+ 조혈 줄기세포의 체외 적혈구 분화 방법을. FACS와 유전자 변형 기술을 활용하여 골수형성이상증후군 관련 빈혈 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

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