In vitro 및 ex vivo human erythropoiesis의 효율성을 평가하기 위한 포괄적인 파이프라인

본 연구는 백혈병, 특히 골수이형성 증후군 또는 골수이형성 종양에 초점을 맞추고 있습니다. 조혈모세포에서 유래하는 줄기세포 질환입니다. 그것은 다양한 혈액 세포 계통, 특히 심장 혈액 세포 생산을 담당하는 적혈구 계통에 영향을 미칩니다.

이 계통의 붕괴는 MDS 환자에서 흔히 볼 수 있는 빈혈로 이어질 수 있습니다. 이 기사에서 제공하는 파이프라인을 통해 유전자 변형 또는 약물 치료 시 체외에서 인간 적혈구 세포의 효율성을 평가할 수 있는 강력하고 간소화된 방법을 사용할 수 있습니다. 조혈모세포는 태어날 때부터 생의 마지막 순간까지 존재합니다.

우리 유기체에는 매일 수조 개의 세포가 생성되는 증식 조직이 더 이상 없습니다. 아직 이해해야 할 것이 너무 많기 때문에 우리는 단백질체와 RNA 생물학에 중점을 두고 건강한 아미노 조직에 있는 이 놀라운 세포를 계속 연구할 것입니다. 시작하려면 섭씨 37도로 설정된 수조에 바이알을 30초 동안 담궈 100, 000개의 CD34+UCB 세포를 해동합니다.

바이알에 1ml의 해동 매체를 적가한 다음 위아래로 피펫팅하여 셀을 부드럽게 재현탁시킵니다. 재현탁된 세포 현탁액을 한 방울 한 방울 떨어뜨려 5ml의 제상 매체로 옮깁니다. 그런 다음 실온에서 320G에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.

10ml의 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 완충액으로 DNAse를 사용하여 세포를 세척합니다. 세포를 다시 원심분리한 후 펠릿을 2ml의 자극 매체에 재현탁합니다. 2ml의 세포 현탁액을 24웰 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 형광 활성화 세포 분류 튜브에 세포를 수집하고 1ml의 줄기 세포 배지를 채웁니다. 바이러스를 해동한 후 자극 매체에 필요한 부피를 추가하여 30의 감염 배수를 달성합니다. 바이러스 100마이크로리터당 100, 000개의 세포를 밀도로 바이러스 함유 배지에 펠릿화된 세포를 재현탁하고 96웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.

빈 우물에 PBS를 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 웰에서 1ml의 줄기 세포 배지가 있는 FACS 튜브로 전체 부피의 세포 현탁액을 옮깁니다. 웰과 피펫 팁을 줄기세포 배지로 세척하여 FACS 튜브에 2ml의 줄기세포 배지를 추가합니다.

FACS 튜브를 원심분리한 후 상등액을 버리고 세포 펠릿을 2ml의 팽창 배지에 재현탁합니다. 현탁액을 24웰 플레이트의 웰로 옮기고 세포를 배양합니다. 먼저 EGFP 리포터로 transduction된 CD34+cells의 전체 부피를 별도의 FACS tube로 옮깁니다.

320G에서 실온에서 8분간 원심분리기. 펠릿화된 세포를 100마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 튜브당 5마이크로리터의 CD34 항체를 추가하고 섭씨 4도의 어두운 곳에서 20분 동안 튜브를 배양합니다.

그런 다음 실온에서 320G에서 8분 동안 DAPI와 원심분리를 포함하는 1ml의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁합니다. DAPI가 포함된 200마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시킨 후 분류하기 전에 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 PBS에 있는 비드 한 방울에 0.5마이크로리터의 CD34 항체를 추가합니다.

혼합물을 섭씨 4도의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 혼합물에 PBS 1ml를 첨가합니다. 실온에서 320G으로 8분간 원심분리기를 합니다.

상등액을 버리고 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, GFP 음성 및 GFP 양성 백혈병 세포를 FACS 튜브에 추가합니다. 1ml의 FACS 완충액으로 세포를 세척합니다.

세포를 원심분리한 후 100, 000 GFP 음성 세포와 100, 000 GFP 양성 세포를 각각 500 마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 분류하기 전에 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 그런 다음 줄기 세포 배지에서 분류된 세포를 수집합니다.

실온에서 320G에서 8분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 3ml의 적혈구 분화 배지에 세포를 재현탁합니다. 이제 1ml의 재현탁 세포를 24웰 플레이트의 3개의 웰에 분배합니다.

모든 외부 우물을 PBS로 채웁니다. 매체를 새로 고치려면 세포가 플레이트 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. 플레이트를 부드럽게 기울이고 500마이크로리터의 미디어를 제거합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 2X 사이토카인 적혈구 분화 배지를 추가하여 플레이트를 새로 고칩니다. 6일차에 세포를 12웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 1ml의 배지를 추가하여 최종 부피인 2ml에 도달합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에서 200마이크로리터의 세포를 수집합니다.

제거된 부피를 250마이크로리터의 2X 적혈구 분화 배지로 교체합니다. 각 수집 튜브에 1ml의 FACS 버퍼를 추가합니다. 튜브를 원심분리한 후 펠릿화된 세포를 100마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다.

CD71, CD34 및 CD235a 항체를 각각 1마이크로리터씩 튜브에 추가합니다. 그런 다음 DAPI를 포함하는 1ml의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 320G으로 8분 동안 튜브를 원심분리합니다.

DAPI로 200마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. DAPI 대 side scatter 또는 SSC를 설정하여 dead cell을 제외합니다. SSC 높이 대 SSC 면적을 설정하여 응집체를 제외하고 단일 셀을 선택합니다.

크기에 따라 파편을 제거하기 위해 SSCA에 비해 전방 산란 영역을 설정합니다. CD235a와 CD71을 설정합니다. CD34와 SSCA를 비교합니다.

비드를 GFP 양성 세포와 DAPI 염색 세포를 실행합니다. 판독값을 보상하고 보상을 세포분석기 설정에 적용합니다. 탯줄 혈액에서 추출한 CD34 양성 세포는 Annexin V 양성 세포사멸 세포가 4일째 14.4%에서 17일째 34.2%로 증가했다.

막대 그래프는 17일째까지 Annexin V 양성 세포의 비율이 크게 증가하여 약 40%에 도달했음을 보여줍니다