낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

[해설자] 이 연구는 UHS 기술이 낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하는 데 이점을 제공하는지 여부를 결정하는 것을 목표로 하는 정자 최적화 방법에 중점을 둡니다. 미세유체 기술은 DFI가 낮은 고품질 정자 선택을 최적화하는 데 활용되었습니다. UHS 방법의 주요 한계는 고품질 정자의 자가 수영 능력에 대한 의존도가 높다는 것입니다. UHS 방법은 정자가 완전히 움직이지 않는 환자에게는 적합하지 않습니다. Thigmotaxis는 정자 분리에 중요한 역할을 합니다. U자형 궤도는 경계가 길어 고품질 정자의 자유로운 이동을 촉진하여 움직이지 않는 정자, 불순물 및 기타 구성 요소로부터 완전히 분리할 수 있습니다. DGC 기술에 비해 UHS 레인 방식은 실험실 직원의 수동 작업 단계가 적고 UHS 레인 방식을 통해 얻은 고품질 정자는 반복적인 원심분리 절차를 거치지 않아 DFI가 낮습니다. 시작하려면 수술기에 20마이크로리터의 비료 배지를 추가하여 U자형 트랙을 만듭니다. 피펫으로 10마이크로리터의 비료 배지를 빨아들여 U자형 트랙의 왼쪽 시작점에 원형 물방울을 만듭니다. 비료 배지를 사용하여 U자형 트랙의 왼쪽 중간 부분을 따라 간격을 두고 각각 10마이크로리터의 완충 방울 2개를 만듭니다. 모든 물방울을 비료 배지로 연결하여 연속적인 트랙을 형성합니다. 2.5마이크로리터의 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 사용하여 U자형 트랙의 오른쪽에 긴 액체 방울 스트립을 만듭니다. PVP 스트립의 오른쪽에 있는 난자 처리 배지를 사용하여 6개의 미세방울을 만듭니다. 접시에 배양유 7밀리리터를 추가하여 오일이 물방울의 가장 높은 지점을 완전히 덮도록 합니다. 접시를 섭씨 37도, 6% 이산화탄소 인큐베이터에 밤새 넣어 평형을 유지합니다. 정액을 채취한 후 계량 방법을 사용하여 부피를 측정하여 0.01밀리리터의 정확도를 보장합니다. 정액 샘플을 섭씨 37도 환경에 15-30분 동안 두고 광구경 플라스틱 일회용 피펫에 흡인합니다. 정액이 60분 이내에 액화되지 않으면 같은 양의 수정 배지를 첨가하십시오. 완전히 액화될 때까지 일회용 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 혼합물을 반복적으로 흡입하고 내쉬십시오. 6에서 10 사이의 정밀 pH 시험지를 사용하여 정액의 pH 값을 측정합니다. 완전히 액화된 정액 10마이크로리터를 가져다가 황반 계수 챔버에 떨어뜨립니다. 광학 현미경을 사용하여 200X 필드에서 정자 운동성을 평가합니다. ICSI 수술 접시의 U자형 트랙의 왼쪽 시작점에 있는 수정 배지 미세방울에 5마이크로리터의 정액을 추가합니다. 4X 대물 렌즈 아래에서 난자 고정 바늘과 주사 바늘의 각도와 위치를 조정합니다. 설정을 확인한 후 선택한 난모세포를 ICSI 작동 접시의 난자 처리 배지 미세방울로 옮깁니다. 난모세포가 들어 있는 수술 접시를 준비된 현미경 작업자의 뜨거운 단계에 놓습니다. 초점을 조정한 후 주사 바늘을 ICSI 수술 접시의 PVP 스트립으로 내립니다. 주사 바늘을 U자형 트랙 오른쪽의 긴 스트립으로 이동하여 고품질 정자를 추출합니다. 정자를 오른쪽의 PVP 스트립으로 옮기고 정자를 수술접시 바닥에 놓습니다. 정자 꼬리의 중간 또는 아래쪽 부분에 있는 주사 바늘을 부드럽게 누릅니다. 주사 바늘을 재빨리 뒤로 당기고 정자를 긁어 고정시킵니다. 이제 꼬리에서 머리까지 정자를 주사 바늘로 흡입합니다. 난자의 세포질에 정자를 천천히 주입하고 주입된 난모세포를 배양합니다. 1.5밀리리터의 45% 밀도 구배 원심분리 용액을 15밀리리터의 멸균 원추형 바닥 시험관에 첨가합니다. 그리고 45% 구배 용액의 바닥에 1.5밀리리터의 90% 밀도 구배 원심분리 용액을 천천히 첨가합니다. 이제 액화된 정액을 구배 원심분리 용액에 넣고 튜브를 실온에서 300G에서 15분 동안 회전시킵니다. 상청액을 제거한 후 남은 정자 침전물 약 0.5ml를 채취하여 3ml의 수정 배지와 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 200G에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 피펫팅하여 약 0.2밀리리터의 침전물을 남긴 다음 흔들어 혼합하여 침전물을 재현탁시킵니다. 마지막으로, 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 섭씨 37도, 6% 이산화탄소 인큐베이터에 보관하기 전에 정자 농도와 운동성을 계산합니다. 25마이크로리터의 저융점 아가로스 용액이 들어 있는 튜브를 섭씨 90도에서 100도의 수조에 1-2분 동안 넣습니다. 그런 다음 온도가 안정될 때까지 튜브를 섭씨 37도의 수조에 5분 동안 옮깁니다. 3-10마이크로리터의 정액을 저융점 아가로스 튜브에 넣고 완전히 섞습니다. 혼합물 30마이크로리터를 수평 위치의 전처리된 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 뚜껑을 덮은 후 사전 처리된 유리 슬라이드를 섭씨 2도에서 8도의 냉장고에 4분 동안 넣고 수평 위치를 유지하도록 합니다. 냉장고에서 슬라이드를 제거하고 덮개 유리를 부드럽게 밀어냅니다. 전처리된 유리 슬라이드를 변성 용액에 7분 동안 빠르게 담급니다. 슬라이드를 제거하고 똑바로 세웁니다. 그런 다음 여과지를 사용하여 시편 영역을 건드리지 않고 과도한 물방울을 흡수합니다. 슬라이드를 증류수로 5초 동안 씻습니다. 유리 슬라이드를 특정 기간 동안 적절한 용액에 연속적으로 담그십시오. 그런 다음 전처리된 유리 슬라이드를 수평으로 유지하고 약 1밀리리터의 혼합 염료 용액을 슬라이드에 추가합니다. 5분 동안 염색한 후 스테인드 글라스 슬라이드를 증류수로 10-15회 부드럽게 헹굽니다. 점진적인 운동성이 좋은 고품질 정자가 U자형 트랙의 가장자리를 따라 부드럽게 헤엄쳐 세포질 내 정자 주입 바늘이 개별적으로 잡기 쉬웠습니다. 두 가지 방법을 모두 사용하여 양호한 정자를 얻었지만, 밀도 구배 원심분리법을 사용하여 분리된 고품질 정자의 DNA 단편화 지수는 U자형 수평 수영법에 비해 유의하게 높았습니다.