Name: In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 학습하세요 CaFE 리포터를 이용한 C. elegans 수정 및 초기 배아 발생 중 칼슘 과도 현상 시각화 방법을. 조기 배출된 난모세포에서 지연된 칼슘 파동과 단일 세포 칼슘 과도 현상을 관찰하여 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초기 발달 단계에서 칼슘 추적

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>한천</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 킬로그램; 분말은 플레이크보다 쉽게 용해됩니다</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500g</td></tr><tr><td>알코올 램프</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>95% 에탄</td></tr><tr><td>올 염화암모늄(NH4Cl)</td>과 함께 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250g</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5g</td></tr><tr><td>AMSCO 400 시리즈 소형 스팀 살균기</td><td>Steris 헬스케어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>박토 펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>박토 트립톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 스피닝 디스크 컨포칼</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Leica 현미경과 함께 사용됨</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Cytogenics Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>팩당 144개의 슬라이드</td></tr><tr><td>플랫 노즈 플라이어, 부드러운 턱</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>플라이어가 부드러운 턱인지 확인</td></tr><tr><td>이소프로필 &beta;- d-1-thiogalactopyranoside&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; 다이옥산이 없는</td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>0.5인치 테이프는 현미경 슬라이드를 테이프로 붙이는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10g</td></tr><tr><td>황산마그네슘(MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>1 oz 팩</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS 요소 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>컨포칼</td></tr><tr><td>OP50 대장균</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>AA1159436 500g</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성 헵타하이드레이트(Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3kg</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시 (35mm x 10mm)</td> <td>CellTreat</td><td>229638케이스</td><td>당 960 페트리</td></tr><tr><td>접시 멸균 페트리 접시 (60mm x 15mm)</td> <td>CellTreat</td><td>케이스</td><td>당 229665 500 페트리 접시</td></tr><tr><td>균주 EAG16 spn-4p :: jGCaMP7s : :p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td> <td>EAG16</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG25 spn-4p :: jGCaMP7s :: 파이-1U; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Created by E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Created by Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech 웜 픽 핸들</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500g</td></tr></tbody></table>

in vivo visualization of calcium transients during fertilization and early development in c. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

이 원고에 요약된 프로토콜을 사용하여 수정과 배발생에서 칼슘 신호의 역동적인 패턴이 예쁜꼬마선충에서 관찰되었습니다.
CaFE 리포터를 포함하는 기생충의 일반적인 수정 순서는 그림 2에 나와 있습니다. 분석을 용이하게 하기 위해 CaFE 리포터와 플렉스트린 상동성 도메인(PH-mCherry) 전이유전자13을 결합한 EAG28 균주를 사용했습니다. PH-mCherry 마커는 원형질막에 국한되어 특히 생식선에서 세포 경계를 더 쉽게 시각화할 수 있습니다. EAG28 균주는 CaFE 리포터를 포함하는 EAG16 균주와 OD70 PH-mCherry 리포터 균주13을 교차시켜 생성되었습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서는 배란과 수정이 동시에 일어납니다. 수정의 시간 0은 배란 난모세포에서 형광 신호가 감지되는 첫 번째 프레임으로 간주됩니다(그림 2). 난모세포의 앞 가장자리가 정자의 저장 기관인 정자(spermatheca)에 들어가자마자 정자 융합 부위에서 밝은 형광이 발생합니다7. 배란이 완료되기 전에 신호가 나타납니다. 칼슘파는 이위상(biphasic)이며, 빠른 초기 폭발 후 진입점에서 반대쪽 극을 향한 형광파가 뒤따릅니다. 전체 난모세포는 &lt;30초 후에 형광이 됩니다.
CaFE 리포터는 단일 사본에 있으므로 신호는 다른 transgenes만큼 밝지 않습니다. Z-stack 타임랩스는 회전 디스크 공초점이 사용 가능하고 최적화되지 않는 한 배란 중에는 권장되지 않습니다. 생식선 형태학의 3D 변화를 캡처하기 위해 영화 전후에 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 여기에 있는 이미지는 컨포칼 현미경으로 촬영한 것이지만, 과도 현상은 컨포칼보다 더 일반적이고 저렴한 광시야 형광 현미경을 사용하여 관찰되었습니다. 레이저 스캐닝 컨포칼을 사용하면 프레임 속도는 약 1fps입니다. 회전 디스크 컨포칼을 사용하면 프레임 속도가 10fps 이상입니다. CaFE 리포터의 배경 신호는 생식선에서 성숙한 난모세포를 비추기에 충분합니다. 수정 시 일반적으로 GFP 신호 강도가 1.5-2배 증가하는 것이 관찰됩니다.
정량 분석을 위한 몇 가지 대체 방법이 있습니다. 예를 들어, Oxford Instruments(Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼 현미경과 동일한 모회사)에서 만든 Imaris 이미지 분석 소프트웨어는 더 큰 ROI 대신 통과 난모세포에서만 각 프레임의 신호를 정량화할 수 있습니다. 그러나 Imaris 소프트웨어는 무료가 아닙니다. 또한, 난모세포 내 칼슘파를 측정하기 위한 상세한 이미지 분석 전략은 Takayama, Fujita 및 Onami에 의해 매우 상세하게 기술되었으며 무료로 사용할 수 있는 ImageJ를 사용합니다14. 또는 단일 난모세포를 가로지르는 형광 신호파를 설명하기 위한 카이모그래프는 여기에 설명된 것보다 더 광범위한 이미지 조작이 필요하지만 Takayama 및 Onami3에 설명되어 있습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)의 뚜렷한 장점은 내인성 RNAi15,16을 유발하기 위해 dsRNA를 발현하는 벌레 박테리아에 공급함으로써 거의 모든 유전자의 발현을 녹다운할 수 있다는 것입니다. 최적의 dsRNA 발현을 위해 RNAi 플레이트와 포화 RNAi 배양 모두에 IPTG가 포함되어 있습니다. dsRNA는 측면 프로모터(flanking promoter)로 관심 유전자를 발현하여 생성됩니다. 여기에서는 16,256개의 박테리아 균주를 사용하여 대부분의 웜 게놈을 표적으로 하는 Ahringer 라이브러리를 사용했습니다17. 또는 Vidal 실험실에서 Gateway 시스템을 사용하여 ~11,000개의 RNAi 클론으로 구성된 ORFeome을 생성했으며 Horizon Discovery18을 통해 구입할 수 있습니다.
RNAi와 결합한 CaFE 리포터의 유용성을 입증하기 위해 조배란을 조사했습니다. ipp-5 의 부분적 결실은 이중 배란 사건을 유발하여 -1 난모세포와 -2 난모세포가 동일한 배란 기간 동안 정자로 들어갑니다19. IPP-5는 IP3에 작용하여 IP3 두 번째 전달자의 수준을 효과적으로 감소시키는 인산가수분해효소입니다. 우리는 ipp-5 의 RNAi 녹다운이 돌연변이와 유사한 이중 배란 표현형을 유도한다는 것을 발견했습니다.
ipp-5 RNAi 녹다운에 의해 유도된 이중 배란 중 CaFE 리포터를 분석한 결과 OET의 새로운 측면이 밝혀졌습니다. 첫째, 칼슘 신호는 선행 -1 난모세포에서 정자로 진입하자마자 즉시 관찰되었지만 후행 -2 난모세포에서는 관찰되지 않았습니다(그림 3). 2개의 난모세포가 배란을 하지만, -1 난모세포는 여전히 적절한 성숙의 징후, 특히 핵막(NEBD)의 파괴를 보이는 유일한 난모세포입니다. 이러한 데이터는 -2 난모세포가 정자가 존재하더라도 아직 제대로 성숙하지 않았기 때문에 수정될 능력이 없음을 시사합니다. 둘째, -2 난모세포는 일반적으로 난모세포가 자궁을 위해 정자를 빠져나갈 때 지연된 칼슘파를 나타냅니다. 난모세포 성숙은 일반적으로 배란의 전제 조건이지만, 이러한 데이터는 난모세포의 성숙과 수정 능력이 배란 후에도 여전히 발생할 수 있음을 시사합니다. ipp-5 knockdown 중 지연된 칼슘파의 시각화는 수정 역량 및 타이밍을 조사하기 위한 CaFE 리포터의 이점을 강조합니다.
또한, 우리는 CaFE 리포터가 산란란에서 검출될 수 있으며 예쁜꼬마선충의 초기 배발생 동안 단세포 칼슘 과도 현상을 드러낸다는 것을 발견했습니다. 동기화된 1일차 성체 EAG28(CaFE; PH-mCherry) 웜은 Zyla 카메라를 사용하여 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼과 함께 섹션 1-5의 프로토콜을 사용하여 이미지화되었습니다(그림 4). 칼슘 과도 현상은 단일 세포에 국한되어 있으며 수정 칼슘파보다 완료하는 데 시간이 덜 걸립니다(~9 s, n=11). 그러나 배발생 중 칼슘파는 이위상(biphasic)으로 보이지 않습니다. 칼슘 과도현상은 8세포 단계 이전에는 관찰되지 않았습니다. 특히, 칼슘은 인간과 Xenopus20,21,22를 포함한 다른 많은 유기체에서 볼 수 있는 것처럼 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 분열 고랑에 국한되지 않습니다. 단세포 칼슘 과도 현상은 배아 형성 후(수정 후 ~200분) 및 산란란에서 잘 관찰되었습니다. 단일 배아는 시간이 지남에 따라 여러 칼슘 과도 현상을 나타내지만 다른 세포에서 일반적으로 한 번에 하나의 세포에서 나타납니다. 레이저 자극에 지속적으로 노출되면 배아가 손상될 수 있습니다. 낮은 LED/레이저 출력 또는 불연속 노출을 권장합니다. 그러나 칼슘파는 ~9초로 비교적 짧기 때문에 LED/레이저 자극 이벤트 사이에 2초 미만으로 느린 것은 권장하지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
그림 1: 예쁜꼬마선충 생식선 팔. EAG25 웜 균주의 한 생식선 팔의 이미지, CaFE 리포터 GFP (녹색)와 생식 계통의 핵을 강조하는 히스톤 2B-mCherry 마커 (빨간색)를 보여줍니다. 근위 난모세포는 정자가 저장되는 정자 바로 앞에 -1로 표시됩니다(화살표). 정자에 가장 가깝지만 자궁 내부에 위치한 배아는 가장 최근에 태어난 배아입니다. 이미지는 Nikon ECLIPSE Ti2 레이저 스캐닝 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
그림 2: 수정 중 칼슘파의 시각화. EAG28 웜 균주에서 수정 중 세포 내 칼슘을 반영하는 형광의 시계열 이미지. EAG28 균주에는 CaFE 리포터 (녹색)와 pleckstrin-homology domain-mCherry 융합 (노란색)이 모두 포함되어 있으며, 이는 원형질막을 강조합니다. 시간 0은 난모세포에서 형광 신호의 명확한 증가를 나타내는 첫 번째 프레임을 나타냅니다. 시간 24.4초는 전체 난모세포 형광을 보여주는 첫 번째 프레임을 반영합니다. 시계열 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
그림 3: ipp-5 RNAi에 의한 이중 배란 중 칼슘파. ipp-5 RNAi에 노출된 EAG16 균주(GFP 녹색의 CaFE)에서 -1 난모세포와 -2 난모세포의 순차적인 칼슘파의 저속 촬영 이미지. -40.0 s 프레임에는 -1 난모세포(-1), -2 난모세포(-2), 정자(*) 및 +1 배아(+1)에 대한 레이블이 포함됩니다. 시간 0 s는 -1 난모세포의 칼슘파의 형광의 초기 증가를 표시합니다. 시간 4.5초는 -1 난모세포의 반대쪽 극으로 퍼지는 칼슘파를 보여줍니다. 시간 70.5초는 기준선 GFP 신호에서 -2 난모세포와 함께 -1 난모세포의 전체 세포 형광을 표시합니다. 두 난모세포는 모두 정자(spermatheca)에 있습니다. 수정된 -1 난모세포와 수정되지 않은 -2 난모세포는 158.3초에 자궁으로 들어갑니다. 219.3초에서 -2 난모세포는 후기 형광 칼슘파를 나타냅니다. 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바 = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
그림 4: 초기 배발생에서의 단세포 칼슘 과도현상. (A) 자궁 내 배아 및 (B) 자궁 밖 (낳은 난자)은 배아 발생 중 단일 세포에서 형광 신호를 나타냈습니다. 이미지는 Zyla 카메라와 함께 Andor Dragonfly 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 촬영했습니다. 눈금 막대 = 20μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

in-vivo-visualization-calcium-transients-during-fertilization-early

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

출처: Bancroft, E. A., et al. 1차 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적 Ca2+ 플럭스와 그 하류 효과를 정량화합니다. J. Vis. Exp. (2020){{TAG_ 46}}이 비디오는 마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 지표(calcium indicator)를 발현하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 컨포칼 현미경으로 뉴런을 이미지화하여 자발적 및 신경전달물질에 의한 칼슘 활동 중 형광 강도의 변화를 추적합니다.

마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

학습하세요 CaFE 리포터를 이용한 C. elegans 수정 및 초기 배아 발생 중 칼슘 과도 현상 시각화 방법을. 조기 배출된 난모세포에서 지연된 칼슘 파동과 단일 세포 칼슘 과도 현상을 관찰하여 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화) (동영상) | JoVE Journal

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

더 많은 동영상 탐색