In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

생존 가능한 배아의 생산은 복잡한 과정입니다. 우리의 전반적인 목표는 난모세포에서 배아로의 전환을 조정하는 세포 신호를 정의하는 것입니다. CaFE 리포터는 수정 시와 초기 배발생 중에 발생하는 칼슘 신호를 시각화하기 위해 개발된 새로운 도구입니다.

CaFE 리포터를 사용하여 조산된 난모세포에서 지연된 칼슘 파동을 발견했습니다. 우리는 또한 초기 배발생 동안 단세포 칼슘 과도현상(single-cell calcium transients)의 존재를 발견했다. 두 연구 결과 모두 초기 발달 과정에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표의 유용성을 보여줍니다.

칼슘 난모세포를 시각화하는 이전 기술은 생식선에 염료를 주입하는 데 의존했습니다. 이 기술은 노동 집약적이며 특수 마이크로 주입 장비가 필요합니다. CaFE 리포터를 사용하면 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 난모세포와 배아의 칼슘파를 쉽게 시각화할 수 있습니다.

CaFE Reporter는 난모세포와 배아에서 칼슘 신호의 시기와 조절에 대한 조사를 용이하게 합니다. 이 리포터는 기존 돌연변이, 마커 및 RNAi 녹다운과 쉽게 결합하여 근세포 성숙과 같은 초기 배발생 동안 다른 획기적인 사건과 관련된 칼슘의 거동을 밝힐 수 있습니다. 시작하려면 웜 픽 손잡이를 잡고 은색 칼라를 머리 쪽으로 풀어 네 부분이 분리되도록 합니다.

네 섹션 중간에 1.5인치 백금 와이어를 놓습니다. 칼라를 조이면서 중앙의 와이어를 잡고 4개의 섹션을 함께 가져옵니다. 한 쌍의 플랫 노즈 플라이어를 사용하여 와이어 모양을 조심스럽게 만들고 와이어 끝을 반복적으로 조여 약 2-3mm 피트를 만듭니다.

이 발을 사용하여 벌레를 집으십시오. 물에 3% 아가로스 용액을 준비하고 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 가열합니다. 긴 축을 가로질러 단일 층의 실험실 테이프가 있는 두 개의 다른 현미경 슬라이드 사이에 빈 현미경 슬라이드를 놓습니다.

1밀리리터 피펫을 사용하여 가열된 3% 아가로스 용액을 빈 슬라이드 중앙에 떨어뜨립니다. 빈 슬라이드에 수직인 아가로스 방울에 새 현미경 슬라이드를 빠르게 놓고 방울이 인접한 테이프 슬라이드를 가로질러 놓인 다음 패드를 그대로 유지하면서 슬라이드를 부드럽게 분리합니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 M9 완충액에 있는 1밀리몰 레바미솔을 아가로스 패드 중앙에 소량 떨어뜨려 기생충을 마비시킵니다.

최소 5개의 동기화된 웜을 선택하고 웜 픽 핸들의 발을 레바미솔 방울에 부드럽게 터치하여 웜을 옮깁니다. 커버 슬립으로 아가로스 패드를 조심스럽게 덮습니다. 덮개가 미끄러지면 벌레가 흩어질 수 있으므로 벌레의 위치를 확인하십시오.

현미경 슬라이드에 웜 균주의 이름과 같은 적절한 세부 정보를 표시하십시오. 명시야 조명을 사용하는 현미경의 저전력 대물렌즈를 사용하여 벌레를 찾습니다. 난모세포의 칼슘파를 명확하게 시각화하기 위해 최소 20x 공기 대물렌즈 또는 40x의 침수 대물렌즈를 사용합니다.

형광 리포터의 최적 시각화를 위해 GFP 및 RFP 채널의 게인 또는 노출 시간을 조정하십시오. 기생충의 생식선 팔에 있는 각 마이너스 1 난모세포를 검사하여 수정 사건이 임박했는지 확인합니다. 핵막이 파괴된 후, 가장 근위부에 있는 마이너스 1 난모세포의 세포골격은 재배열되어 둥근 모양을 띠며 마이너스 2 난모세포와 분리됩니다.

배란이 임박하면 즉시 광시야 설정에서 비디오 녹화를 시작하십시오. 근위 난모세포(proximal oocyte)는 정자가 저장되는 정자(spermatheca) 바로 앞에 마이너스 1(minus-one)로 표시됩니다. 가장 최근의 배아는 정자에 가장 가깝지만 자궁 내부에 있습니다.

칼슘파는 급격한 폭발로 시작하여 진입점에서 반대쪽 극으로 이동하는 형광파가 뒤따르는 이위상 패턴을 보였습니다. 칼슘 신호는 선행 마이너스 1 난모세포에서 정자에 진입하자마자 즉시 관찰되었지만, 후행 마이너스 2 난모세포에서는 관찰되지 않았습니다. 자궁 내 배아(in-utero)와 자궁 밖(ex-utero) 배아는 배발생 동안 단일 세포에서 형광 신호를 나타냈습니다.