Name: Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatase의 개발 및 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 학습하세요 라파마이신 조절 시스템을 이용한 티로신 포스파타제 활성 제어 방법을 HEK-293T 세포에서. 이 기술은 SHIP-2 활성화에 따른 세포 형태 변화와 이동성 연구에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Rapamycin-Regulated System을 이용한 인산가수분해효소 활성의 시간적 조절

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)는 과다한 세포 신호 전달 사건에 관여하는 중요한 단백질군입니다. 그들은 세포 증식, 이동 및 세포 사멸 1,2,3의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)의 조절 장애는 쇠약하게 하는 다양한 질병 및 장애를 유발한다 4,5,6,7. 티로신 인산가수분해효소의 생리학적 기능과 이러한 병리학의 발달에 대한 그들의 역할을 연구하는 것은 역사적으로 인산가수분해효소 신호전달의 복잡성을 조사하는 데 필요한 도구의 부족으로 인해 방해를 받아왔다8.
전통적으로 인산가수분해효소는 원하는 특이성을 갖지 못하거나 활성에 대한 시간적 제어를 제공하지 않는 방법을 사용하여 연구됩니다. 사용 가능한 도구의 이러한 중요한 한계로 인해 신호 전달 경로에서 인산가수분해효소의 특정 역할을 분석하는 것이 어렵습니다. 구성적으로 활성화되고 우세한 음성 돌연변이의 과발현 또는 인산가수분해효소 발현의 하향조절은 특이성을 제공하지만 시간적 제어가 부족하고 종종 효소의 실제 기능을 가리는 보상 메커니즘을 유발할 수 있습니다.
약리억제제는 인산가수분해효소의 시간적 조절을 가능하게 합니다. 그러나 많은 인산가수분해효소 억제제는 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)에서 활성 부위의 조성이 잘 보존되어 있기 때문에 비특이적인 것으로 악명이 높다9. 또한, 설계 제약으로 인해 촉매 부위를 표적으로 하는 억제제는 세포막 투과성이 불량하다10. 억제제의 또 다른 한계는 인산가수분해효소 불활성화(phosphatase inactivation)의 효과에 대한 검사만을 허용한다는 점이다11. 따라서, 인산가수분해효소의 특정적이고 시간적으로 조절 가능한 활성화를 가능하게 하는 도구가 필요합니다. 이러한 도구를 통해 연구자들은 인산가수분해효소 활성화의 직접적인 효과를 식별할 수 있으며, 종종 생물학적 자극에 의해 활성화되는 여러 병렬 신호 캐스케이드로부터 이를 분리할 수 있습니다. 중요한 것은, 활동의 엄격한 시간적 통제를 통해 인산가수분해효소에 의해 유도된 일시적인 사건을 식별할 수 있고 급성 및 장기간의 인산가수분해효소 활성의 영향을 분리할 수 있다는 것입니다. 시간적 조절과 돌연변이 분석을 결합하면 인산가수분해효소의 개별 영역의 특정 역할을 자세히 해부하고 그 다운스트림 신호전달을 조사할 수 있다12.
기존 도구에서 원하는 기능의 부족을 해결하기 위해 Karginov 그룹은 Rapamycin Regulated (RapR) 시스템 13,14,15를 개발했습니다. RapR 시스템은 관심 단백질(POI)의 알로스테릭 조절을 가능하게 하는 엔지니어링된 스위치 도메인인 iFKBP를 활용합니다. POI의 촉매 부위에 알로스테릭하게 결합된 위치에 iFKBP 도메인을 삽입하면 라파마이신에 의한 조절에 취약해집니다. 라파마이신이 없는 경우, iFKBP는 본질적으로 높은 iFKBP의 높은 구조 역학으로 인해 촉매 부위를 파괴하여 POI를 비활성화합니다. 라파마이신의 첨가는 iFKBP와 동시 발현 단백질 FRB의 상호작용을 유도합니다(그림 1). 이로 인해 스위치 도메인이 안정화되어 결과적으로 POI의 촉매 도메인의 구조와 기능이 복원됩니다. 따라서 이 도구를 사용하면 POI를 구체적이고 임시로 조정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> 그림 1: RapR-Shp2 라파마이신 조절 시스템의 개략도. RapR은 라파마이신을 첨가하여 관심 단백질의 알로스테릭 활성화를 가능하게 합니다. 이 그림은 Fauser et al.12에서 수정되었습니다. 약어: iFKBP = 삽입 가능한 FKBP12; FRB = FKBP-라파마이신 결합 도메인; R = 라파마이신; Shp2 = Src 상동성-2 도메인 함유 단백질 티로신 인산가수분해효소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
RapR 도구는 다양한 단백질군에 적용할 수 있습니다. 그것은 단백질 키나아제뿐만 아니라 phosphatases12,14를 통제하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 Shp2 인산가수분해효소를 제어하기 위한 RapR 도구의 적용에 중점을 둡니다. Shp2는 증식, 이동, 면역 조절 및 분화와 같은 신호 전달 과정에 관여하는 유비쿼터스 방식으로 발현되는 단백질 티로신 인산가수분해효소입니다 1,16,17,18. Shp2의 조절 장애는 여러 고형암, 골수성 백혈병 및 발달 장애와 관련이 있습니다 5,7. 그러나 Shp2는 위에서 설명한 것과 동일한 도구 단점의 희생양이 되었습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 구체적이고 시간적으로 조절 가능한 Shp2 구조체인 RapR-Shp2가 개발되고 특성화되었다12.
RapR-Shp2의 개발 이전에, Shp2가 세포 이동에 관여하는 것이 알려졌다 19,20,21. 그러나 이 과정과 관련된 신호에서 구체적인 역할은 알려지지 않았습니다. 또한 Shp2가 세포의 이동을 조절하는 시간 척도와 활성화의 다른 시점에서 유도하는 특정 형태 역학적 변화가 무엇인지도 알려지지 않았습니다. 또한, Shp2의 급성 및 장기간의 활성화가 다른 효과를 일으키는지 여부가 불분명했다. RapR-Shp2를 사용하여 Shp2의 급성 활성화가 일시적인 세포 확산, 돌출부 증가, 세포 분극 및 이동을 유도하는 것으로 나타났습니다. 뚜렷한 형태역학적 변화를 조절하는 Shp2의 하류에 있는 특정 경로도 확인되었다12. 이 프로토콜은 RapR-Shp2의 설계 및 특성화에 대한 세부 정보를 제공하며, 이는 다른 RapR 인산가수분해효소의 개발 및 응용을 안내하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td># 1.5 유리 커버 슬립 25mm 라운드</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 버퍼</td><td></td><td></td><td>500 mL : 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL 글리세롤, 52.5 mL 20 % SDS, 0.5 g 브로 모페놀 블루, 최종 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20 % Mini-PROTEAN TGX 프리 캐스트 젤</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 세포 챔버</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>벤치마크 소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>열 비활성화 트리플 0.1 &마이크로; m 멸균 여과</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>10.1083/JCB.201306067에 게시</td></tr>됨 <tr><td>CellMask Deep Red plasma membrane dye</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competent 세포</td>, <td>NEB</td>, <td>C2987H</td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM,</td><td>코닝</td>, <td>15-013-CV</td><td></td></tr>, <tr><td>DMSO</td>, <td>써모 사이언티픽</td><td>F-515</td><td></td></tr>, <tr><td>DNA 사다리</td>, <td>GoldBio</td>, <td>D010-500</td><td></td></tr>, <tr><td>dNTP,</td><td>NEB</td>, <td>N04475</td><td></td></tr>, <tr><td>DpnI, 효소</td>, <td>NEB,</td><td>R01765</td><td></td></tr>, <tr><td>DTT,</td><td>GoldBio</td>, <td>DTT10</td>, <td>DL-디티오트레이톨, Cleland의 시약</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>소 혈장에서 추출한 피브로넥틴</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET 겔 추출 키트</td></tr><tr><td>Gel Green Nucleic Acid Stain</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 염료 퍼플, 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A,</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td>, <td>Gibco</td><td>35050-061</td>, <td>GlutaMAX-L(100x), 100mL</td></tr>, <tr><td>HEK 293T 셀,</td><td>ATCC,</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr>, <tr><td>HeLa 셀</td><td>, ATCC</td><td>, CRM-CCL-2</td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr>, <tr><td>ImageJ 프로세싱 소프트웨어</td><td>,</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸 완충액</td><td></td><td></td><td>25 mM 이미다졸 pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천</td><td></td><td>Fisher BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b 업데이트를 사용하여 CellGeo 기능</td></tr><tr><td>Metamorph 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>유전자 Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔 12웰</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 등급 Water</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>다중대역 다색성 미러</td><td>크로마 기술</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x 대물</td>렌즈 <td>올림푸스</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca and Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8-스트립 튜브 및 캡, 강성 스트립 개별 부착 돔 캡</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>면역 블롯 PVDF/여과지 샌드위치</td></tr><tr><td>라파마이신</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신, 2.21mM EDTA, 1x [-] 나트륨</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate-EDTA (TAE) 전기</td><td>영동용</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td> 50x</tr><tr><td>Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag 항체</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH 항체</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry 항체</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxillin 항체</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 항체</td><td>세포 신호</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-paxillin Y31 항체</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-PLC&gamma; Y783 항체</td><td>세포 신호</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC&gamma; 항체</td><td>세포 신호</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

rapamycin-regulated tyrosine phosphatase의 개발 및 응용

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

그림 4는 팍실린 기반 인산가수분해효소 활성 분석에서 기대할 수 있는 결과를 보여줍니다. 이 실험에서, 구성적으로 활성화되고 우세한 음성 Shp2 인산가수분해효소 활성을 포스포-팍실린을 판독값으로 사용하여 활성 및 비활성 RapR-Shp2의 활성과 비교하였다. Shp2 작제물을 면역침전시키고, 프로토콜에 기술된 바와 같이 활성 분석을 실시하였다. 구성적으로 활성화된 Shp2 및 활성 RapR-Shp2에 대한 포스포-팍실린 판독값은 유사했으며, 이는 활성 RapR-Shp2가 RapR 도메인의 도입에 의해 부정적인 영향을 받지 않았으며 활성화된 후 전체 활성을 유지했음을 나타냅니다. 우세한 음성 Shp2 및 비활성 RapR-Shp2도 유사했는데, 이는 RapR-Shp2 구조체가 비활성 상태일 때 활성을 갖지 않음을 나타낸다. 이는 RapR-phosphatase의 성공적인 설계를 나타냅니다. 이 분석에 사용되는 인산염 기질은 관심 인산가수분해효소에 따라 다를 수 있습니다.
그림 4와 유사한 그림 5는 구성적 활성, 우성 음성, 활성 및 비활성 RapR-Shp2를 비교합니다. 이 실험은 작제물의 면역침전 없이 수행되었습니다. 대신, 세포 내 RapR-Shp2 구조체의 다운스트림 신호 효과를 특성화하도록 설계되었습니다. 여기서, Shp2 구조체는 HEK293T개의 세포에서 발현되었다. 다운스트림 이펙터 ERK1/2는 구성적 활성 샘플에서와 마찬가지로 RapR-Shp2 활성화에 대한 반응으로 인산화가 증가하는 것으로 나타났습니다. 비활성 RapR-Shp2는 이러한 변화를 유도하지 않았다. 이는 Shp2의 다운스트림 시그널링이 RapR 도메인의 통합과 함께 보존됨을 나타냅니다. 유사하게, 공지된 인산-기질 EGFR 및 PLCγ는 A431 세포에서 RapR-Shp2 활성화에 반응하여 탈인산화되었다.
마지막으로, 그림 6 은 HeLa 세포의 형태역학에 대한 RapR-Shp2 활성화 결과를 보여줍니다. RapR-Shp2가 활성화되면, 세포는 세포 면적뿐만 아니라 돌출 활성의 증가를 보여주었습니다. 이는 RapR-Shp2 활성화가 HeLa 세포에서 형태역학적 변화를 유도하기에 충분하며 연구자가 이 효과의 원인이 되는 특정 다운스트림 신호 경로를 조사할 수 있음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> 그림 4: 팍실린 기반 활성 분석의 결과: 구성적 활성, 우성 음성 및 RapR-Shp2를 면역침전시키고 개요된 프로토콜을 사용하여 활성 분석을 수행했습니다. CA와 RapR-Shp2 모두에서 pY31 팍실린의 수준은 유사했으며, 이는 RapR-Shp2 구조체가 활성화된 후 CA Shp2와 비교하여 유사한 활성을 가졌음을 나타냅니다. 활성화되지 않은 RapR-Shp2 샘플은 DN 샘플과 유사하게 활성이 없었으며, 이는 "누출"이 아님을 나타냅니다. 이 그림은 Fauser et al.12에서 수정되었습니다. 약어: RapR = 라파마이신 조절; Shp2 = Src 상동성-2 도메인 함유 단백질 티로신 인산가수분해효소; DN = 우성 음수; CA = 구성적 활성; FRB = FKBP-라파마이신 결합 도메인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> 그림 5: 전체 세포 용해물 분석 결과: HEK293T 세포에서 구성적 활성, 우성 음성 및 RapR-Shp2가 발현되었고 전체 세포 용해물 프로토콜이 완료되었습니다. 비활성 상태일 때 RapR-Shp2는 DN Shp2 샘플과 유사하게 인산화에 의해 ERK1/2를 활성화하지 않았습니다. 이는 RapR-Shp2가 비활성 상태일 때 활동이 없음을 나타냅니다. 일단 활성화되면, ERK1/2 인산화 수준은 CA Shp2 샘플의 수준과 유사했으며, 이는 Shp2의 성공적인 활성화 및 다운스트림 신호 전달을 나타냅니다. 유사하게, RapR-Shp2를 발현하는 A431 세포는 SHP2의 알려진 기질인 EGFR 및 PLCγ 모두의 인산화 감소를 보여주었다. 이 그림은 Fauser et al.12에서 수정되었습니다. 약어: RapR = 라파마이신 조절; Shp2 = Src 상동성-2 도메인 함유 단백질 티로신 인산가수분해효소; DN = 우성 음수; CA = 구성적 활성; ERK = 세포외 신호 조절 키나아제; GAPDH = 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소; EGFR = 표피 성장 인자 수용체; PLCγ = 포스포리파제 C 감마; FRB = FKBP-라파마이신 결합 도메인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> 그림 6: 실시간 이미징을 기반으로 한 세포 면적 및 돌출 활성 데이터 분석: HeLa 세포는 RapR-Shp2로 transfection하고 설명된 라이브 이미징 프로토콜에 따라 투여되었습니다. 데이터는 데이터 분석 프로토콜에 설명된 대로 분석되었습니다. 활성화되면(수직 회색 선으로 표시) HeLa 세포는 세포 돌출 활동과 세포 면적 모두에서 증가를 보였습니다. FRB만 발현하는 음성 샘플에서는 이 활성이 나타나지 않았습니다. 이는 RapR-Shp2 활성화가 HeLa 세포 내에서 빠른 형태역학적 변화를 유도하고 세포 확산 및 돌출을 촉진한다는 것을 나타냅니다. 이 그림은 Fauser et al.12에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatase의 개발 및 응용

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

development-application-rapamycin-regulated-tyrosine

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

이 연구에서는, 우리는 Crohn의 섬유증에 비교병생리학을 전시하는 TNBS 중재장 섬유증의 상세한 절차를 기술합니다. 우리는 또한 라파마이신이 장 섬유증에 대한 억제 효과를 촉진에 비추어이 접근법을 논의합니다.

TNBS 중재장 섬유증의 발달에 기계론적 통찰력 과 라파마이신의 억제 효과 평가

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

제프리 D. Rothstein는 병리학과 루게릭병이나 루게릭병, ALS 연구 발전, 그리고 치료법의 발전으로 현재의 전략을 기본 메커니즘에 대해 말한다.

ALS - 모터 신경 질환 : 새로운 치료법의 원리 및 개발

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

학습하세요 라파마이신 조절 시스템을 이용한 티로신 포스파타제 활성 제어 방법을 HEK-293T 세포에서. 이 기술은 SHIP-2 활성화에 따른 세포 형태 변화와 이동성 연구에 활용됩니다.

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