Name: Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 인간 관절 연골에서 효소 소화 및 피브로넥틴 부착 분석법을 이용해 연골세포와 연골형성세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>연골형성체(Chondroprogenitor and Chondrocyte Isolation from Human Articular Cartilage)

<ol><li>Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+effectiveness+of+various+treatments+for+cartilage+defects+compared+to+microfracture%3A+A+network+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cartilage+Joint+Preserv%22%5BJournal%5D)">Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials.</a> J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).</li>
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<li>Muthu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cartilage+regeneration%3A+emerging+hypotheses+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies.</a> Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).</li>
<li>Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+osteogenic+and+chondrogenic+differentiation+of+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).</li>
<li>Fernandez-Moure, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+cortical+bone%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).</li>
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<li>Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fresh+chondrocytes%2C+cultured+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage.</a> Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).</li>
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<li>McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+equine+articular+cartilage+progenitor+cells+and+bone+marrow-derived+stromal+cells+as+potential+cell+sources+for+cartilage+repair+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse.</a> Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).</li>
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<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarticular+injection+of+allogenic+chondroprogenitors+for+treatment+of+osteoarthritis+in+rabbit+knee+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model.</a> J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).</li>
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<li>Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+for+cartilage+repair+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthopaed%22%5BJournal%5D)">Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models.</a> J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22-메스 블레이드&nbsp;</td><td>유리잔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>J6012</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>130223</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신-B (2 &mu; g/mL)입니다.</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산(62 &mu; g/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>BC CytoFLEX LX 유세포 분석기&nbsp;</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>CYTExpert 소프트웨어 버전 2.5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA ALDRICH&</td><td>nbsp; C34006</td><td></td></tr><tr><td>CD105-FITC</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 561443 <tr><td>CD106-APC</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 551147 <tr><td>CD14-FITC</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 555397 <tr><td>CD29-APC</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 559883 <tr><td>CD34-PE</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>CD45-FITC</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td> 347463</tr><tr><td>CD49b-FITC</td><td>밀테닐 바이오텍</td><td>&nbsp; MACS 130/100337</td><td></td></tr><tr><td>CD49e-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555617 <tr><td>CD73-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 550257 <tr><td>CD90-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>561970</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>DE NOVIX</td><td>Cell Drop BF</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>HIMEDIA</td><td>TCP024</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>MODEL-371</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 X 형(COL10A1), 런트 관련 전사 인자(RUNX2), SRY-Box 전사 인자 9(SOX-9), 아그레칸(ACAN) 및 콜라겐 II형(COL2A1)&nbsp;</td><td>EUROGENTEC, 벨기에</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II형</td><td>WORTHINGTON</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>D8900-1L</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 플레이트 리더</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>SpectraMax i3x 리더</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>FISHER SIENTIFIC</td><td>2353459</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>CLOUD CLONE CORP</td><td>APA551Hu01</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴(10 &micro; L/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>First-Strand 합성 시스템</td><td>TAKARA BIO</td><td>6110A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39411</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>M8787</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>SIGMA</td><td>1320065</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR 열순환기&nbsp;</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>즈 Quantstudio 12K Flex 열순환기&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(100 IU/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red</td><td>ALFA AESAR</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체(마우스 콜라겐 II)</td><td>DSHB</td>, <td>DSHB II II6B3</td><td></td></tr>, <tr><td>Pronase</td><td>ROCHE</td><td>10165913103</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT, Picogreen dsDNA 시약</td><td>, THERMO SCIENTIFIC</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>냉장고</td><td>ELANPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniKit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39962</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체 (염소 안티-마우스 IgG 항체, HRP 접합체)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>흔들리는 물 목욕&nbsp;</td><td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemPro 차별화 키트&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>1007201, A1007001, 그리고 A1007101</td><td></td></tr><tr><td>T-25 플라스크&nbsp;</td><td>코닝</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TakyonTM Low Rox SYBR 마스터 믹스 dTTP 블루&nbsp;</td><td>EUROGENTEC</td><td>UF-LSMT-B0701</td><td></td></tr><tr><td>TGF&베타;</td><td>ABCAM</td><td>ab277760</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 페트리디쉬</td><td>TARSONS</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루</td><td>QUALIGENS</td><td>2040</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

fibronectin adhesion and migratory assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

Isolation of Chondrocytes and Chondroprogenitors Using Fibronectin Adhesion and Migratory Assay

86.9mg의 연골 절편에서 1.72 x 105 세포의 연골 세포 수율이 관찰되었습니다. 로딩 시, 연골세포는 즉시 부착하여 초기에는 둥근 조약돌 모양을 나타내고 추가 팽창 시 섬유아세포 상태로 변형됩니다(그림 1 A, B). 이러한 연골세포를 피브로넥틴 플레이트에 파종하면 일반적으로 2%의 접착력이 발생하며, 각 세포는 클론 성장(그림 2 C, D)을 거쳐 10-12일(32개 세포/클론)까지 5배의 개체군 두 배에 도달합니다. 10cm² 면적 내의 클론을 결합하고 FAA-CP를 생산하는 데 필요한 통로까지 확장합니다. 콜라겐분해효소 배양 후 배양에서 지속된 연골 외식은 세포외 기질이 느슨해지는 것을 보이며, 일반적으로 7일 째부터 이동이 관찰됩니다(그림 2E). FAA-CP와 MCP는 모두 BM-MSC와 일반적으로 관련된 특성인 스핀들 모양의 구조를 표시하며, 합류 전에 벌집 모양의 구조를 획득합니다(그림 1E, F).
세 가지 유형의 분리된 세포, 즉 연골세포, FAA-CP 및 MCP는 위상차 이미징을 사용하여 면밀히 모니터링됩니다. FAA-CP는 5개의 개체군 배가가 확인된 후에만 이전됩니다.
분리 및 확장된 세포의 표현형 특성화에는 일반적으로 연골 형성의 추정 마커, 즉 CD146 및 CD166에 대한 유세포 분석과 연골 형성 마커(SOX-9, ACAN, COL2A1), 섬유 연골 마커 COL1A1 및 비대 마커(RUNX2 및 COL10A1)에 대한 유전자 발현 분석이 포함됩니다. 세 세포 그룹 모두 CD105, CD73 및 CD90의 높은 발현(&gt;95%)을 나타냅니다. CD34 및 CD45의 낮은 발현에서 음성 발현; CD166의 높은 발현(&gt;98%)과 CD146의 중등도 공여체 의존성 발현(40%-75%)(그림 2A).
qRT-PCR 결과는 평가 전에 세포를 배양함에 따라 SOX-9, ACAN 및 섬유 연골 마커인 COL1A1의 유사하고 높은 발현을 보여줍니다(그림 2B). 연골 형성의 확인을 위해 모든 세포 그룹에서 Safranin O 다음에 GAG 함유 영역에서 주황색-빨간색 복합체의 양성 흡수가 관찰되고 Alcian Blue 및 Toluidine Blue에 따른 푸르스름한 자줏빛 복합체가 관찰되며 FAA-CP 및 MCP 그룹에서 더 높은 비율로 관찰됩니다. 콜라겐 유형 II에 대한 연골 생성 분화 펠릿의 면역 조직 화학 분석은 세 그룹 모두에서 갈색 섬유 흡수를 보여줍니다 (그림 3). 또한, GAG/DNA 분석은 FAA-CP 그룹이 더 높은 발현을 보이는 연골 형성 분화를 확인하는 결과를 보여주었습니다(그림 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig01.jpg"> 
그림 1: 연골세포와 연골형성세포의 분리 및 특성화. 연구 알고리즘은 분리 직후와 며칠 간의 확장 후 위상차 현미경 아래에서 3개의 세포 그룹과 그 형태학적 특징을 분리하는 것을 묘사합니다. (A) 갓 분리된 연골 세포는 배양 초기에 부착 배양에 부착하여 추가 확장과 함께 섬유아세포 모양을 획득합니다(B). (C) 피브로넥틴 접착 분석을 받은 연골세포는 클론 성장을 나타내어 10일째까지 개체군이 5배로 증가했습니다(D). (E) 연골 형성 동물은 배양 10일째까지 외식의 가장자리에서 이동하고 더 확장되는 방추 모양의 성장 패턴을 나타냅니다(F). 위상차 이미지 배율 : 10x; 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig02.jpg"> 
그림 2: 분자 특성화 데이터. (A) 양성 및 음성 MSC 마커 및 잠재적 연골 형성 마커에 대한 유세포 분석. (B) 연골형성 및 비대 마커의 유전자 발현 분석을 위한 3개의 세포 그룹에 대한 RT-PCR 발현 데이터. (C) 연골 생성 분화 펠릿의 총 GAG/DNA 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig03.jpg"> 
그림 3: 연골형성 분화에 따른 확인 염색. 세 세포 그룹 간의 콜라겐 유형 II에 대한 Safranin O 및 면역조직화학 분석. 스케일 바 : 10 배 배율, 50 μm; 40배 배율, 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

Chondroprogenitor cells (CPCs), recently identified as a distinct subpopulation, exhibit promise due to their mesenchymal properties, heightened ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

슬개골 지방 패드 중간엽 줄기세포(IFP-MSC)는 무릎 관절의 슬개골하 지방 패드에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 그들은 시험관 내에서 잘 증식하고 CFU-F 콜로니를 형성하며 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화합니다. 본원에서, 염소 스티플 조인트로부터 IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화를 위한 방법론이 제공된다.

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

우리는 침략과 pseudohyphal 차별화의 수단으로 효모 접착 및 한천 침공에 대한 질적 분석을 설명합니다. 이 간단한 분석은 다양한 돌연변이의 침략 표현형뿐만 아니라 효과 환경 단서를 평가하고 효모 차별에 대한 경로를 신호하는 데 사용할 수 있습니다.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

자기 눈썹 만든 전문 해부 도구 -이 비디오는 눈썹 나이프의 사용을 포함하여 Xenopus laevis의 배아에서 주최 및 동물 극 explants의 준비에 사용되는 기술을 설명합니다. 유착 분석을 조립을위한 프로토콜은 또한 주요 유착 분자의 존재에 대한 프로브가 표면 주최자 또는 적절한 개발을위한 중요 동물 극 세포에 존재하는, 주어진 것입니다.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

학습하세요 인간 관절 연골에서 효소 소화 및 피브로넥틴 부착 분석법을 이용해 연골세포와 연골형성세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

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