Name: 조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 조직공학을 위한 전단력 기반 콜라겐 하이드로겔 제조법을. 나노섬유 패턴을 가진 생체재료를 저렴한 장비로 제작하여 세포 상호작용을 유도하고 재생 의학에 활용하는 방법입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Directed Patterning을 사용한 엔지니어링 나노섬유질 콜라겐 제작

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</ol>

<table><tbody><tr><td>콜라겐 I, 고농도, 쥐 꼬리</td><td>코닝</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000-U 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-U&nbsp;</td><td>도립 현미경</td></tr><tr><td>매우 두꺼운 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-267-005</td><td>콜라겐 압출 표면에 잘 작동</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>주사 전자 현미경</td></tr><tr><td>유리 커터 도구 세트 2mm-20mm 연필 스타일 오일 피드 카바이드 팁</td><td>Amazon/MOARMOR</td><td>B07Y1D243H</td><td>유리 커터 옵션</td></tr><tr><td>Hamilton Kel-F 허브 블런트 포인트 바늘 (루어 잠금, 22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>콜라겐 압출용 바늘</td></tr><tr><td>Nexterion Slide H 3-D</td><td>Schott</td><td>NC0782819</td><td>소수성 슬라이드</td></tr><tr><td>PBS 정제 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 8000</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Seamless Cellulose Dialysis Tubing&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 투석 클립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Synthware Glass Cutter</td><td>Synthware</td><td>31-501-927</td><td>유리 커터 옵션</td></tr></tbody></table>

조직공학을 위한 nanofibrillar patterned collagen 생산

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

이 프로토콜은 정렬(그림 2) 또는 무작위(그림 3) 배향 나노피브릴로 구성된 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 간단한 전단 기반 압출 기술을 설명합니다. 나노 피브릴 패터닝은 전단력의 정밀한 제어에 의존하며, 이는 주사기 속도와 콜라겐 압출 속도의 결합된 조절을 통해 달성됩니다. 원섬유 정렬을 유도하기 위한 최적 값은 이전에 340mm/s의 주사기 속도와 3.2mL/분의 콜라겐 압출 속도인 것으로 결정되었습니다28,29. 이 균형은 정렬된 나노피브릴 형성뿐만 아니라 거시적 규모에서 하이드로겔의 기능을 보장하는 데에도 중요합니다. 이 비율이 잘못 정렬되면 예상대로 패턴화되지 않은 하이드로겔뿐만 아니라 너무 얇거나(직경 &lt;0.5mm) 두껍거나(직경 &gt;1.5mm) 물결 모양의 콜라겐 스트립이 포함된 하이드로겔이 제작될 위험이 있습니다. 예를 들어, 주사기 움직임이 너무 빠르고 압출 속도가 너무 느리면 얇은 스트립이 생성되는 반면, 반대 비율은 비율의 불균형 정도에 따라 두껍거나 물결 모양의 스트립을 생성합니다(그림 4A-D). 이러한 거시적 특성의 차이는 세포 증착 및 국소 접착에 영향을 미치기에 충분한 스트립 간 변동성을 생성할 수 있습니다.
콜라겐 압출 및 조립 후, 하이드로겔 제조는 1x PBS에서 세척 단계를 거치기 전에 종종 1-3시간의 초기 건조 단계를 통해 진행됩니다(그림 2 및 그림 3). 최적의 지형적 결과를 달성하는 것은 세척 단계의 타이밍과 강도 사이의 섬세한 균형에 달려 있습니다. 불충분하거나 지연된 세척은 섬유 지형을 파괴하는 결과를 낳으며, 이는 원섬유에 PBS 염 결정의 각인으로 표시됩니다. 대조적으로, 콜라겐 제조 후 과도하거나 조기에 세척하면 지형적 특징을 덮는 콜라겐 층이 용해됩니다(그림 4E, F).
주사전자현미경(SEM)은 콜라겐 하이드로겔 내에서 정렬되거나 무작위 나노피브릴 배향의 존재를 확인합니다. 정렬된 하이드로겔과 무작위 하이드로겔 모두에서 나노 피브릴은 30-50 nm 사이의 피브릴 직경을 나타냅니다29. 질적으로 정렬된 하이드로겔은 일축으로 정렬된 나노피브릴을 함유하고 있음이 분명합니다(그림 5). 이 정렬은 이전에 2D 고속 푸리에 변환 분석을 사용하여 정량화되었으며, 정렬 플롯은 정렬된 하이드로겔에 대해 180° 떨어진 두 개의 뚜렷한 피크를 표시하며, 저주파 피크만 나타내는 무작위 배향의 하이드로겔과 대조됩니다28.
1차 마우스 골격근 근아세포의 명시야 이미지는 콜라겐 원섬유의 이방성 나노 지형 안내가 세포 정렬을 촉진한다는 것을 보여줍니다(그림 6). 이러한 나노 패턴 콜라겐 하이드로겔은 근아세포(myoblasts)뿐만 아니라 26 내피 세포(endothelial cell)23,24와 같은 다른 세포 유형에서도 세포 정렬을 유도하는 것으로 나타났습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
그림 1: 초고밀도 콜라겐 및 절단 유리 슬라이드 준비의 개략도.(A-F) 콜라겐 투석 과정: (A) 3인치 스트립으로 투석 튜브를 준비하고 첫 번째 클립을 고정, (B) 고밀도 스톡 콜라겐을 튜브에 적재하고 두 번째 클립을 고정, (C) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 플레이크로 로드된 투석 튜브를 감싸고, (D) 포화 PEG 플레이크 제거, (E) PEG 플레이크를 물로 헹굽니다, (F) 초고밀도 콜라겐을 마이크로 원심분리기 튜브에 보관합니다. (지엘) 유리 슬라이드를 절단하는 과정: (G) 연구를 위한 유리 슬라이드 획득, (H,I) 다이아몬드 팁 유리 커터로 유리 슬라이드의 채점, (J) 점수가 매겨지지 않은 쪽에서 유리 슬라이드를 깨뜨리기, (K) 절단된 유리를 물로 헹구기, (L) 유리 슬라이드의 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
그림 2: 정렬된 콜라겐 하이드로겔 제조 공정.1단계: 10x PBS 가온 완충액으로의 전단 하의 콜라겐 압출 및 섬유형성 유도; 2단계: 절단 유리 슬라이드에 압출 콜라겐 장착; 3단계: 하이드로겔의 크기를 증가시키기 위해 추가 압출 콜라겐 장착; 및 4단계: 콜라겐 하이드로겔 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
그림 3: 무작위 콜라겐 하이드로겔 제조 공정. 1 단계 : 절단 유리 슬라이드 (단일 스트립)에 콜라겐 압출; 2단계: 콜라겐의 지속적인 압출은 크기(여러 스트립)를 증가시킵니다. 3단계: 섬유형성을 시작하기 위해 압출된 콜라겐을 10X PBS 완충액에 담그는 것; 및 4단계: 하이드로겔 건조. BioRender를 사용하여 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
그림 4: 콜라겐 하이드로겔 제조 공정에서 가능한 오류 단계. (A-F) (A) 최적으로 두꺼운 콜라겐 스트립, (B) 과도하게 두꺼운 콜라겐 스트립, (C) 불충분하게 두꺼운 콜라겐 스트립, (D) 구불구불한 콜라겐 스트립 및 (E,F) 과도하게 세척된 콜라겐 표면의 예. 주사 전자 현미경을 사용하여 표시. 스케일 바 = 1μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
그림 5: 정렬된 콜라겐 하이드로겔 및 무작위 콜라겐 하이드로겔의 주사 전자 현미경 이미지. 이미지는 전자 현미경을 사용하여 촬영했습니다. 빔 조건은 2keV, 전류 범위는 25-100pA, 작동 거리는 4-5mm로 설정되었습니다. 이미지는 6144 x 4096 픽셀의 해상도로 1μs의 체류 시간으로 일관되게 저장되었습니다. 스케일 바 = 1μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
그림 6: 정렬된 무작위 콜라겐 하이드로겔에서 배양된 1차 마우스 근아세포. Myoblasts는 이미징 전 3일 동안 하이드로겔에서 배양되었습니다. 명시야 이미지는 도립 현미경을 사용하여 10배 배율로 촬영했습니다. 화살표는 정렬된 나노 피브릴 방향을 나타냅니다. 스케일 바 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

production-of-nanofibrillar-patterned-collagen-for-tissue-engineering

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

이 모델 시스템은 비파괴 방식으로 내생 콜라겐 (재) 조직 리얼 타임으로 공부하는 데 사용할 수있는 근섬유 채워진 섬유소 젤에서 시작됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 세포 소스, 중간 첨가제와 함께 사용할 수있는, 매우 조정할 수 있으며, 특정 요구에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

수용성 제 1 형 콜라겐 (COL1)의 분리에 대한 기존의 절차 때문에 긴 버퍼 배양 및 섬유의 힘든 resuspensions의 처음부터 끝까지 약 10 일이 필요합니다. 여기, 우리는보다 3 시간에 작은 피부 생검에서 COL1을 정화 할 수있는 방법을 설명합니다.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

미세유체 소자 내에서 기능적 미세조직을 생성하려면 미세장치의 제한된 공간 차원에 전통적인 세포 배양 기술을 적용하여 세포 표현형을 안정화해야 합니다. 콜라겐의 변형은 간세포와 같은 일차 세포를 미세유체 조직 모델로 안정화할 수 있는 초박형 콜라겐 어셈블리의 층별 증착을 가능하게 합니다.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

생체 내 조직의 구조적 특징, 구성 요소 및 기계적 특성과 유사한 3차원 구조를 엔지니어링하기 위해 혁신적인 생체 제조 기술이 개발되었습니다. 이 기술은 새로 개발된 희생 재료인 BSA 고무를 특징으로 하며, 이 고무는 세부적인 공간 특징을 전달하여 다양한 조직의 생체 내 구조를 재현합니다.

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

학습하세요 조직공학을 위한 전단력 기반 콜라겐 하이드로겔 제조법을. 나노섬유 패턴을 가진 생체재료를 저렴한 장비로 제작하여 세포 상호작용을 유도하고 재생 의학에 활용하는 방법입니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

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