정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝
2025년 2월 28일
정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석은 표적 단백질과 선택적으로 결합하는 공유 단편을 식별하는 형광 기반 방법입니다. 여기에는 qIT 분석을 설명하기 위한 자세한 프로토콜이 요약되어 있으며 결과 예가 포함되어 있습니다.
우리는 화학과 생명 과학 부서를 오가며 다양한 항암 약물 표적을 위한 새로운 보조 반응성 공유 리간드를 개발하고 있습니다. 이 분자가 미래에 치료제나 화학 프로브로 사용될 수 있기를 바랍니다. 따라서 공유 리간드를 선별하기 위한 몇 가지 기술이 존재합니다.
이는 크게 배양된 세포와 함께 화합물을 배양하는 단백질체학 기술과 분자가 라벨링하는 단백질을 결정하는 데 사용되는 질량 분석법과 친전자성 라이브러리가 개별 단백질과 함께 배양되는 표적 기반 방법으로 나눌 수 있습니다. 중요한 실험적 과제는 공유 리간드의 반응성과 관련이 있습니다. 과도하게 반응하는 분자는 스크리닝 분석 중에 히트로 나타나는 경우가 많지만 세포의 많은 다른 단백질을 비선택적으로 라벨링하기 때문에 적합하지 않습니다.
따라서 활성의 복합은 공유 약물 발견의 모든 단계에서 고려하는 것이 중요합니다. 그래서 Imperial의 Mann과 Armstrong 그룹은 정량적 비가역적 테더링(Quantitative Irreversible Tethering) 또는 qIT 분석이라고 하는 단백질 표적에 대해 친전자성을 스크리닝하는 새로운 방법을 개발했습니다. 당사의 프로토콜은 단백질 표적에 대해 친전자성을 스크리닝하는 매우 필요한 새로운 방법을 제공하며, 이는 확장 가능하고 질량 분석이 필요하지 않으며 복합 고유 반응성을 제어합니다.
시작하려면 필요한 모든 원액을 준비하고 실험 전에 2시간 동안 실온에 두십시오. 약 30분 동안 아르곤 가스로 정량적 탈기, 비가역적 테더링 또는 qIT 분석 버퍼를 제거합니다. 완충액 교환을 수행하려면 탈기된 qIT 분석 완충액을 초과하는 단백질 용액을 스핀 필터 장치에 희석하고 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000G에서 회전하여 단백질을 농축합니다.
그런 다음 탈기된 qIT 분석 완충액에서 표적 단백질 용액을 15마이크로 어금니 농도로 희석하여 9ml의 용액을 준비합니다. TCEP-아그라오스 용액, qIT 완충액 및 글루타티온 스톡을 384웰 플레이트의 적절한 웰에 분주합니다. fragment library plate의 각 해당 well에서 1.8μl를 전달하여 qIT 분석 버퍼에서 각 화합물을 1.5mmol로 희석하고 3%DMSO를 더한 복합 희석 플레이트를 생성합니다.
384 피펫팅 스테이션을 사용하여 화합물 희석 플레이트의 각 웰에서 20마이크로리터의 복합 용액을 두 반응 플레이트로 옮깁니다. 먼저 원하는 단백질과 글루타티온을 사용하여 정량적 비가역적 테더링 또는 qIT 분석을 설정합니다. 500마이크로몰 CPM 스톡을 마이크로 원심분리기 튜브의 111.2마이크로리터 분취액에 분배하고 섭씨 20도에서 보관합니다.
CPM 스톡을 해동한 후 40ml의 qIT 분석 담금질 완충액에 추가하여 1.4마이크로몰 용액을 준비합니다. 27마이크로리터의 CPM 담금질 용액을 2개의 새로운 384웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 단백질 반응 플레이트를 200G에서 3분 동안 원심분리하여 TCEP-아가로스를 펠렛으로 만듭니다. 미리 결정된 시점에서, 384 피펫팅 스테이션을 사용하여 단백질 반응 플레이트의 모든 웰에서 CPM 담금질 플레이트로 3마이크로리터의 샘플을 옮깁니다.
바닥에서 TCEP-아가로스를 흡입하지 않도록 웰 상단에서 샘플을 제거합니다. CPM 담금질 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하고 384나노미터에서 여기(excitation)와 470나노미터에서 방출로 형광 강도를 측정합니다. 먼저 원하는 단백질로 정량적 비가역적 테더링(tethering) 또는 qIT 분석을 수행하고 CPM 플레이트에서 샘플을 퀀닝합니다.
각 담금질에 대해 Z 프라임을 분석 품질의 측도로 계산합니다. 그런 다음 열 1과 2의 negative control well과 column 23 및 24의 positive control well에 대한 평균 형광 값을 계산합니다. 각 반응을 양성 대조군과 음성 대조군의 평균 형광 값으로 잘 정규화하고, 글루타치온 및 표적 단백질과 반응하는 각 화합물에 대한 시간 대비 변형 백분율을 별도로 플롯합니다.
GraphPad를 사용하여 방정식을 사용하여 두 반응에 대한 정규화된 수정 백분율 대 시간 데이터를 1상 지수 감쇠 모델에 맞추고, AE를 KT C의 거듭제곱에 맞춥니다.각 단편에 대한 속도 향상 계수 또는 REF 값을 계산하기 위해 단편이 단백질 및 글루타티온과 반응하는 속도를 사용합니다. 마지막으로, 히트 프래그먼트를 선택하려면 REF 임계값, 임의의 히트율을 설정하거나 REF가 기하 평균보다 3 표준 편차가 큰 프래그먼트를 선택합니다. 화합물 1은 글루타티온보다 6배 더 빠른 속도로 표적 단백질의 시스테인 잔류물과 반응하여 3보다 큰 REF의 Hit 기준을 충족했습니다.
화합물 2는 글루타티온에 비해 타겟 시스테인 잔기와의 가속화된 반응 속도를 보여주지 않았으며, 이는 생산적인 비공유 상호작용의 부족을 나타내므로 유효 물질로 선택되지 않았습니다.
개요
정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석법은 표적 단백질과 선택적으로 결합하는 공유결합성 프래그먼트를 식별하기 위해 설계된 형광 기반 방법입니다. 본 논문에서는 qIT 분석법의 상세 프로토콜을 설명하며, 적용 사례를 보여주기 위한 예시 결과가 포함되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 공유 결합 약물 발견
- 형광 기반 분석
- 단백질-리간드 상호작용
배경
- 항암 표적을 위한 반응성 공유 결합 리간드의 개발.
- 반응성으로 인한 공유 결합 리간드 스크리닝의 어려움.
- 기존 방법으로는 단백질체학적 기법과 표적 기반 방법이 포함됨.
- 화합물의 반응성을 제어할 수 있는 확장 가능한 방법의 필요성.
연구 목적
- 단백질 표적에 대한 친전자체 스크리닝을 위한 새로운 방법으로 qIT 분석법을 소개합니다.
- 질량 분석법이 필요하지 않은 프로토콜을 제공합니다.
- 신약 개발에서 공유 결합 리간드의 선택성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 스톡 용액 준비 및 qIT 분석 버퍼의 탈기.
- 단백질 농도 측정 및 qIT 분석 버퍼 내 희석.
- 화합물 희석 및 반응 설정을 위한 384-웰 플레이트 사용.
- 화합물 반응성을 평가하기 위한 형광 강도 측정.
주요 결과
- 표적 단백질과의 반응 속도에 기반한 히트 프래그먼트(hit fragment) 식별.
- 선택성을 결정하기 위한 속도 향상 인자(REF) 계산.
- qIT 분석법의 효과를 입증하는 결과 예시.
- 글루타치온 및 표적 단백질에 대한 화합물의 반응성 비교.
결론
- qIT 분석법은 친전자체를 스크리닝하는 강력한 방법을 제공합니다.
- 이 방법은 선택적 공유 결합 리간드의 식별을 가능하게 합니다.
- 본 방법은 공유 결합 약물 발견 분야를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 개요
정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석법을 이용한 공유 결합 프래그먼트 스크리닝은 초기 약물 발견의 핵심 과제인 선택적 공유 결합 바인더와 광범위하게 반응하는 화합물을 구분하는 문제를 해결합니다. qIT는 화합물 고유의 반응성을 정규화하고 정량적 선택성 지표를 제공함으로써, 히트 화합물 식별 및 선별 단계에서의 예측 신뢰도를 높입니다. 이러한 역량은 리스크가 조정된 포트폴리오 추진을 지원하며, 비선택적 반응성으로 인한 후속 단계의 탈락률을 줄여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 표적 검증을 위해 공유 결합 리간드의 선택성에 대한 강력한 조사를 가능하게 합니다.
- 표적 특이적 반응성과 오프타겟 배경을 정량화함으로써 메커니즘적 리스크 감소를 지원합니다.
- 추후 개발을 위해 유리한 선택성 프로파일을 가진 프래그먼트의 우선순위 결정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 친전자성 라이브러리의 고속 스크리닝을 위한 확장 가능한 형광 기반 분석 플랫폼을 제공합니다.
- 표적 단백질과 글루타치온 대조군 모두를 사용하여 반응 속도의 정량적 측정을 표준화합니다.
- 속도 향상 인자(REF) 임계값을 기반으로 선택적 히트를 재현성 있게 식별할 수 있게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 광범위하게 반응하거나 비특이적인 화합물을 배제함으로써, 초기 히트 선정 단계를 중개 연구 요구사항과 일치시킵니다.
- 강건하고 정량적인 선택성 데이터를 생성하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 복잡한 생물학적 시스템 내의 비특이적 공유 결합 변형으로 인한 후기 단계 실패 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
qIT 분석은 히트(hit) 발굴 및 검증 단계에 통합되어, 공유 결합 리간드 프로그램의 초기 발견과 리드 최적화 단계를 연결하는 가교 역할을 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 선택적 공유 결합 결합력을 정량화하여 가설 기반의 타겟 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 화합물 선별을 위해 고처리량의 재현 가능하고 정량적인 결과물을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 화합물의 선택성을 비교하기 위한 REF 값 및 정규화된 동역학 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 비선택적 친전자체를 배제함으로써 전임상 후보 물질 선정에 정보를 제공합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 단백질 타겟 및 친전자체 라이브러리에 적용 가능한 재사용 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 히트 선택성에 대한 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 질량 분석법 없이도 공유 결합 스크리닝 워크플로우를 표준화하고 확장합니다.
- 전략적 가치: 선택적 히트 화합물을 우선순위화함으로써 go/no-go 결정 및 자본 배분을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 기반의 진척을 가능하게 하며, 비선택적 반응성으로 인한 후기 단계의 탈락률을 낮춥니다.
실행 시 고려 사항
- 형광 기반 분석 설정 및 키네틱 데이터 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 384-well 플레이트 핸들링 장비 및 호환 가능한 형광 플레이트 리더기에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 대조군 및 정규화 절차에 대한 팀 간의 엄격한 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 단백질 표적 및 친전자성 프래그먼트 라이브러리에 적용 가능합니다.
- 히트 임계값 결정 및 데이터 품질 평가를 위해 견고한 통계 분석이 필요합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:16
Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
2:48
CPM-Quenching to Quantify the Amount of Unreacted Thiol Remaining in the Protein and Glutathione Reaction Plates of Quantitative-Irreversible Tethering Assay
4:18
Data Analysis and Hit Selection After the Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
