Name: 정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 학습하세요 정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석법을 사용하여 표적 단백질에 선택적으로 결합하는 공유 분절을 스크리닝하는 방법을 배우세요. 이 형광 기반 프로토콜은 질량 분석 없이 선택적 공유 리간드를 식별하여 항암 표적물질 발굴을 가속화합니다.

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1. Fragment library 구축
<ol>
	<li>친전자성 단편의 라이브러리를 설계하고 합성하거나 구매합니다. 친전자성 단편 라이브러리는 일반적으로 다양한 화학 스캐폴드에 첨가된 약반응성 친전자성(예: 아크릴아미드, 클로로아세트아미드 및 비닐 설폰아미드)으로 구성됩니다. 친전자성 단편 라이브러리는 상용 공급업체에서 널리 구할 수 있으며, 설계 및 구성에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 검토됩니다 5,11.</li>
	<li>DMSO의 각 화합물을 50mM의 농도로 용해한 다음 Fragment Library Plate라고 하는 384웰 저장 플레이트의 3-22열 각 웰에 다른 화합물을 분배합니다.<ol>
		<li>positive 및 negative control에 대해 column 1, 2, 23, 24의 각 well에 DMSO를 분배합니다. 플레이트 레이아웃은 스크리닝되는 화합물의 수에 따라 달라질 수 있습니다(그림 2). 라이브러리 플레이트에 추가되는 부피는 qIT 스크리닝당 각 웰에서 약 1.8μL가 필요하다는 점을 고려하여 수행할 스크리닝 수에 따라 달라집니다. 이 Fragment Library Plate를 미리 준비하여 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
그림 2: 플레이트 레이아웃. qIT 분석 384웰 플레이트 레이아웃의 개요입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 분석 설정(그림 3)
<ol>
	<li>다음 용액을 준비합니다: 재조합 단백질 용액(모든 완충액의 표적 단백질), qIT 분석 완충액(150mM NaCl, 25mM Hepes(pH 8)), qIT 분석 담금질 완충액(150mM NaCl, 25mM Hepes(pH 7.5)) 및 복합 원액(DMSO의 친전자성 단편(50mM)). 참고: 반응 버퍼에 pH 8을 사용하여 표적 시스테인 잔기와 단편 간의 반응을 가속화하여 매우 약한 반응성 단편에 대해서도 반응 속도를 측정할 수 있습니다. CPM의 말레이미드와 시스테인 티올 사이에 형성된 티오에테르 결합이 더 염기성 pH에서 가수분해되기 쉽기 때문에 담금질 완충액에는 약간 낮은 pH인 7.5가 사용됩니다(예를 들어, 이전 연구에서는 시스테인-말레이미드 접합체가 pH 8보다 pH 7.3에서 훨씬 더 안정적임을 발견했습니다12).</li>
	<li>DMSO 단편 스톡 용액을 저장소에서 제거하고 화합물 스톡이 해동될 수 있도록 최소 2시간 동안 실온에 둡니다.</li>
	<li>약 30분 동안 아르곤 가스로 버블링하여 qIT 분석 버퍼를 제거합니다.</li>
	<li>표적 단백질 용액을 탈기된 qIT 분석 버퍼로 완전히 교체합니다. 결정적으로, DTT 및 TCEP와 같은 환원제는 티올 정량화를 방해하므로 100nM &lt; 농도로 완전히 제거해야 합니다. 이 단계는 아래에 설명된 대로 반복적인 일련의 버퍼 교환을 통해 수행할 수 있습니다.<ol>
		<li>탈기된 qIT 분석 버퍼를 초과하는 단백질 용액을 스핀 필터 장치에 희석하고 원심분리(4000 x g, 4°C, 15분)를 사용하여 농축한 후 반복합니다. 일반적으로 1mL의 재조합 단백질 스톡 용액에서 DTT(1mM)를 충분히 제거하려면 1/15 희석액을 4회 희석해야 하지만, 이 단계는 원래 재조합 단백질 용액의 환원제 농도에 따라 조정할 수 있습니다. 참고: 또는 대량의 탈기된 qIT 분석 버퍼에 대해 표적 단백질 용액을 투석하면 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>탈기된 qIT 분석 버퍼에서 표적 단백질 용액(단계 2.1에서 생성)을 15μM의 단백질 농도로 희석합니다. 384웰 플레이트를 충분한 데드 볼륨으로 채우려면 약 9mL의 타겟 단백질 용액이 필요합니다.</li>
	<li>탈기된 qIT 분석 완충액에서 TCEP-아가로스의 1.5%(v/v) 현탁액을 준비합니다. 스크리닝 플레이트당 약 9mL의 TCEP-아가로스 현탁액이 필요합니다.</li>
	<li>20μL의 TCEP-아가로스 용액을 2개의 384웰 플레이트의 모든 웰에 분주합니다.</li>
	<li>탈기된 qIT 분석 완충액에서 15μM 글루타티온 스톡을 준비합니다. 이것은 글루타티온이 환원제 없이 용액에서 빠르게 산화되므로 도금 직전에 준비해야 합니다.</li>
	<li>20μL의 qIT 분석 버퍼를 384웰 플레이트의 컬럼 1과 2에 분배합니다.</li>
	<li>20μL의 15μM 단백질 또는 글루타티온 용액(의도한 플레이트에 따라)을 384웰 플레이트의 3-24컬럼에 분주합니다. 이를 단백질 반응판(Protein Reaction Plate) 및 글루타티온 반응판(Glutathione Reaction Plate)이라고 합니다. RT에서 1시간 동안 줄이도록 둡니다.</li>
	<li>58.2μL의 탈기된 qIT 분석 버퍼를 384웰 플레이트의 각 웰에 분주한 다음 Fragment Library Plate의 각 웰에서 1.8μL를 전달하여 각 화합물을 qIT 분석 버퍼에서 1.5mM의 농도와 3% DMSO로 희석하는 복합 희석 플레이트를 만듭니다. 참고: 이 단계는 384-피펫팅 스테이션을 통해 더 쉬워졌으며, 이를 통해 한 번의 작업으로 모든 웰에 대해 화합물 스톡을 이송할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질과 글루타티온을 TCEP-아가로스로 1시간 배양한 후, 복합 희석 플레이트의 각 웰에서 20μL의 복합 용액을 단백질 및 글루타티온 반응 플레이트로 옮겨 분석을 시작합니다. 이 단계는 384 피펫팅 스테이션을 사용하면 더 쉬워집니다. 분석 단계는 그림 3에 요약되어 있습니다. 참고: 단편 농도는 필요에 따라 변경될 수 있으며, 원하는 경우 단백질 친화도가 높은 단편 농도의 인공물이 아닌지 확인하기 위해 더 낮은 농도에서 유효 물질에 대해 qIT 분석을 반복할 수 있습니다. 상대적으로 높은 단편 농도는 kpro 및 kGSH를 상승시켜 경미한 반응성 화합물(분석 조건에서 t1/2(GSH) &gt; 24시간 표시 가능)에 대한 정확한 속도를 결정할 수 있도록 하는 데 사용됩니다. 더욱이, 500μM의 단편 농도가 높지만, 단편 스크리닝에는 높은 μM 내지 낮은 mM 농도가 사용되어 왔다(예:13).</li>
	<li>타이머 시작 - 분석이 시작되었으며 아래 섹션에 따라 일정한 시점에서 담금질을 수행해야 합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
그림 3: qIT 분석 요약. qIT 분석 반응 웰 셋업의 주요 단계를 보여주는 요약입니다. (BioRender를 사용하여 생성). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. CPM 담금질
참고: CPM 담금질은 단백질 및 글루타티온 반응 플레이트에 남아 있는 미반응 티올의 양을 정량화하기 위해 수행됩니다. 이는 반응 역학을 모니터링할 수 있도록 개별 시점(예: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 및 1440분)에서 수행해야 합니다.
<ol>
	<li>DMSO에서 CPM 스톡 용액(500μM)을 준비하고, 마이크로 원심분리 튜브에서 111.2μL 분취액으로 분주한 후 -20°C에서 보관합니다. 이러한 CPM 재고는 미리 준비할 수 있으며, 담금질 시점당 1개의 부분 표본이 필요합니다.</li>
	<li>동결된 CPM 원액(500μM)을 해동하고 이를 40mL qIT 분석 담금질 완충액에 첨가하여 CPM 담금질 용액(1.4μM)을 준비합니다.</li>
	<li>27μL의 CPM 담금질 용액을 2개의 384웰 플레이트의 각 웰에 분배하며, 단백질 및 글루타티온 반응 플레이트를 모두 담금질하는 데 2개가 필요합니다. 이를 CPM-담금질 플레이트라고 하며 사용하기 최대 30분 전에 준비합니다.</li>
	<li>단백질 반응 플레이트를 200 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 TCEP-아가로스가 펠렛화되었는지 확인합니다.</li>
	<li>사전 결정된 시점에서, 단백질 반응 플레이트의 모든 웰에서 3 μL의 샘플을 사전 충전된 CPM 담금질 플레이트로 옮깁니다. 이 단계는 384 피펫팅 스테이션을 사용하여 단순화할 수도 있습니다.</li>
	<li>3 x 25 μL를 흡입 및 분주하여 CPM 퀜치 플레이트를 혼합합니다. CPM 담금질을 방해하는 하단의 TCEP-아가로스를 흡인하지 않도록 웰 상단에서 샘플을 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>글루타티온 반응 플레이트에 대해 3.4-3.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>CPM 담금질 플레이트(3.4-3.6에서 준비)를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>CPM 담금질 플레이트의 형광 강도를 측정합니다(384nm에서 여기, 470nm에서 방출).</li>
</ol>
4. 데이터 분석 및 히트 선택
<ol>
	<li>각 담금질에 대해 Z'를 분석 품질의 측도로 계산합니다. Z' &lt; 0.5의 CPM 담금질은 무시해야 합니다. Z' = 1 - ((3σ양성 대조군 + 3σ음성 대조군) / (μ양성 대조군 - μ음성 대조군)) 여기서 σ = 형광 강도 표준 편차 및 μ = 형광 강도 평균</li>
	<li>negative control well과 positive control well(각각 1열과 2열, 23열과 24열)에 대한 평균 형광 값을 계산합니다.</li>
	<li>각 반응을 positive 및 negative control의 평균 형광 값으로 잘 정규화합니다. % modified = 100 x (복합 웰 형광 - 음성 대조군 형광) / (양성 대조군 형광 - 음성 대조군 형광)</li>
	<li>글루타티온 및 표적 단백질과 반응하는 각 화합물에 대한 시간 대비 수정된 %를 별도로 플롯합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 단백질 및 글루타티온과의 반응 모두에 대한 1상 지수 붕괴 모델에 대한 정규화된 % modified vs. 시간 데이터를 피팅합니다. % 수정 = ae - 캐럿 + c 여기서 a = % modified 값의 범위, k = 반응 속도, t = 시간, c = 무한 시간에서의 % modified 값. 곡선 피팅 및 매개변수 결정은 상용 소프트웨어(예: Graphpad)를 사용하여 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>단편이 단백질(kpro) 및 글루타티온(kGSH)과 반응하는 속도를 사용하여 각 단편에 대한 속도 향상 계수(REF) 값을 계산합니다. 참조 = k프로 / kGSH</li>
	<li>REF 값을 사용하여 히트 조각을 선택합니다. 이는 REF 임계값(예: REF &gt; 3), 임의의 적중률(예: 상위 2%)을 설정하거나 기하 평균보다 큰 REF 3 표준 편차를 가진 조각을 선택하여 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Quantitative-Irreversible Tethering: 친전자성 리간드를 효율적으로 스크리닝

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
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<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

시스테인 반응성 표적 공유 리간드(cysteine-reactive targeted covalent ligand, 특정 단백질에서 선택된 시스테인 잔기와 반응하여 생물학적 효과를 발휘하는 분자)는 최근 수십 년 동안 화학 도구 및 치료제로 점점 더 인기를 얻고 있습니다1. 이는 일반적으로 단백질 표적2에 대한 친화력이 높은 리간드 부분에 첨가된 경미한 반응성 친전자성(예: 아크릴아미드, 클로로아세트아미드 또는 비닐 설폰)으로 구성됩니다. 이상적으로, 리간드-단백질 상호 작용은 초기 비공유 리간드 결합을 포함하는 2단계 메커니즘을 통해 진행된 후 표적 시스테인과 친전자성 3 사이의 비가역적 공유 결합 형성이이루어집니다.
브루톤(Bruton)의 티로신 키나아제(Tyrosine Kinase) 억제제인 이브루티닙(Ibrutinib)을 포함한 여러 초기 표적 공유 리간드는 이전에 확인된 가역적 리간드에 친전자성 핸들(electrophilic handle)을 제공함으로써 개발되었습니다4. 그러나 이 접근 방식이 항상 성공적인 것은 아니며 다른 시도에서는 친전자성 설치에 상당한 최적화가 필요하다는 것을 발견했습니다5. 대신, 특히 친전자성 단편을 사용하는 친전자성 우선 접근 방식이 최근 몇 년 동안 더 인기를 얻고 있습니다. 여기에는 일반적으로 단백질로 친전자성 라이브러리를 배양한 다음 시스테인에 대한 반응 속도가 향상된 화합물을 선택하는 것이 포함되며, 이는 리간드와 결합 포켓6 사이의 생산적인 비공유 상호 작용에 의해 유도되는 것으로 간주됩니다. 특히 이러한 방법은 KRAS(G12C) 억제제 Sotorasib1 개발 과정에서 성공적으로 적용되었습니다.
친전자성 우선 스크리닝은 기존의 비공유 리간드 스크리닝과 비교할 때 몇 가지 고유한 문제를 제기하는데, 이는 주로 탄두 클래스7 내부 및 사이의 반응성 변동성이 높기 때문입니다. 대부분의 시스테인 반응성 친전자성은 시간이 지남에 따라 표적 단백질에 대한 선택적 상호 작용에 관계없이 용매에 노출된 모든 시스테인 잔기와 반응합니다. 따라서 리간드 점유는 거의 모든 친전자성에서 시간이 지남에 따라 증가하며, 반응성을 제어하지 않으면 히트 선택은 종종 타겟과 더 빠르게 맞물리는 더 반응성 단편으로 편향됩니다8.
또한, 친전자성 우선 스크리닝 방법은 종종 질량 분석법을 사용하여 처리량이 제한된 단백질-리간드 부가물 형성을 검출합니다9. 다양한 친전자성(electrophilicity)10을 가진 화합물 라이브러리에 대한 반응 역학을 적절하게 특성화하기 위해 장기간(몇 시간에서 며칠)에 걸쳐 정기적인 반응 샘플링이 필요합니다. 따라서 10개의 시점에서 샘플링된 300개의 단편을 스크리닝하려면 3000개의 질량 스펙트럼을 수행해야 하며, 이는 대부분의 단백질 질량 분석 시스템의 처리량을 초과합니다. 따라서 단백질-리간드 부가물 형성을 모니터링하는 더 높은 처리량의 방법이 바람직합니다.
여기에 설명된 접근 방식인 정량적 비가역성 테더링(qIT) 분석은 내재적 반응성을 제어하고 간단한 형광 판독7을 활용하는 친전자성 우선 스크리닝 방법입니다. 단백질 또는 글루타티온(내재적 반응성의 대조군으로 사용되는 구조화되지 않은 티올 함유 트리펩타이드)을 친전자성 단편 라이브러리와 함께 배양하고, CPM(7-디에틸아미노-3-(4'-말레이미딜페닐)-4-메틸쿠마린, 형광성 티올 정량화제) 용액으로 담금질하기 위해 채취한 일반 샘플을 주입합니다. 시스테인과 친전자성 단편 사이의 부가물 형성은 CPM과 반응할 수 있는 티올의 양을 감소시켜 담금질 시 결과로 발생하는 형광을 감소시킵니다. 따라서 CPM 형광은 미반응 티올에 대한 대용물 역할을 하여 각 친전자성 단편에 대한 티올 반응의 동역학을 측정할 수 있습니다. 글루타티온에 비해 단백질 반응성이 현저히 향상된 친전자성 단편을 유효 물질로 선택하고 추가 개발을 위해 우선 순위를 지정합니다(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
그림 1: qIT의 개략도. qIT 분석의 개략도. (BioRender를 사용하여 생성). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
REF 값을 사용한 유효 물질 선택은 고유 반응성을 제어하고 단백질 표적과 생산적인 비공유 상호작용을 형성하는 경우에만 단편이 유효 물질로 선택되도록 합니다. 또한 간단한 형광 판독은 qIT 분석이 확장성이 뛰어나고 질량 분석 기반 반응 모니터링 방법이 필요하지 않음을 의미합니다.
여기에서는 qIT 분석에 대한 포괄적인 절차를 간략하게 설명하며, 분석 성능 및 히트 선택을 설명하기 위해 예제 결과가 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아르곤 가스</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well, low-flange, flat-bottom assay plates</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Immobilized TCEP-agarose</td><td>Pierce</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Micro plate reader</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 플레이트 씰</td>은 <td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>감소 L-글루타티온</td><td>시그마-알드리치</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>소듐 헤페스</td><td>시그마-알드리치</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

qIT 분석은 이름이 지정되지 않은 단일 시스테인 단백질에 대한 공유 단편 히트를 식별하는 데 사용됩니다. 표적 단백질이 Mg2+ 이온에 결합하는 것으로 알려져 있으므로 MgCl2 (10 mM)를 반응 완충액에 첨가하였다. 스크리닝은 3회에 걸쳐 수행되었으며 각 단편이 표적 단백질(kpro) 및 글루타티온(kGSH)과 반응하는 속도를 측정했습니다. Z' 값은 모든 담금질 플레이트에 대해 0.5 이상이었고 단백질 담금질의 경우 평균 0.75, 글루타티온 담금질의 경우 0.79를 나타내어 우수한 분석 성능을 나타냈습니다. 그런 다음 각 조각에 대해 REF 값을 계산하고 REF가 3인 위치에서 히트&gt; 선택했습니다.
대표적인 결과(그림 4)는 qIT 분석을 사용한 유효 물질 선택의 예를 제공합니다. 화합물 1 은 글루타티온보다 표적 단백질의 시스테인 잔류물과 6.0배 더 빠른 속도로 반응했으며, REF &gt; 3의 기준을 사용하여 히트로 선택되었습니다(그림 4B). 이 속도 가속은 템플릿 효과의 존재를 나타내며, 이에 따라 비공유 상호 작용은 표적 단백질의 시스테인이 클로로아세트아미드 탄두와 반응할 수 있도록 올바른 방향으로 1 을 배치합니다. 대조적으로, 2 는 2 와 타겟 시스테인 잔기 사이의 반응이 2 와 글루타티온 사이의 반응에 비해 가속되지 않기 때문에 비히트 단편의 예입니다. 속도 가속이 부족하다는 것은 생산적인 비공유 상호 작용이 없음을 나타내며, 2 를 타겟 시스테인 잔기와 반응하기 위한 올바른 방향으로 배치합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
그림 4: 대표적인 결과. 그 결과, qIT에 의한 단백질 및 글루타티온 반응 모니터링으로 (A) 높은 고유 반응성, 위양성 히트 단편 및 (B) 히트 단편이 확인되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

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이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

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단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.

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quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

헬름홀츠 젠트럼 베를린의 결정적 단편 스크리닝은 전용 복합 라이브러리, 크리스탈 처리 도구, 빠른 데이터 수집 시설 및 대부분 자동화된 데이터 분석이 있는 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 다운스트림 구조 기반 리간드 설계에 대한 유망한 출발점을 제공하기 위해 이러한 실험의 출력을 극대화할 계획입니다.

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

NMR에 의한 단편 기반 스크리닝은 생체고분자(DNA, RNA 또는 단백질)에 대한 소분자 결합제를 신속하게 식별하는 강력한 방법입니다. 자동화 기반 시료 전처리, NMR 실험 및 획득 조건, 분석 워크플로우를 설명하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술은 검출을 위해 1H 및 19FNMR 활성 핵 모두를 최적으로 이용할 수 있습니다.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

이 백서는 결정 기반 단편 스크리닝을 위한 전체 XChem 프로세스를 설명하며, 액세스 신청부터 데이터 보급에 이르는 모든 후속 단계를 설명합니다.

Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

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DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

학습하세요 정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석법을 사용하여 표적 단백질에 선택적으로 결합하는 공유 분절을 스크리닝하는 방법을 배우세요. 이 형광 기반 프로토콜은 질량 분석 없이 선택적 공유 리간드를 식별하여 항암 표적물질 발굴을 가속화합니다.

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

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