Name: 정밀하게 절단된 간 절편의 생산 및 배양을 위한 최적화되고 단순화된 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 배우세요 생쥐 간에서 정밀하게 절단된 간 절편(PCLS)을 생산하고 배양하는 최적화된 방법을. 바이브라톰을 사용하여 최소 4일간 생존 가능한 조직을 유지하며, 대사 연구와 간 생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>기본 실험실 환경에서 간 절편 배양을 위한 표준화된 프로토콜

<table><tbody><tr><td>3cm 페트리 접시</td><td>세포 배양에 적합한 모든</td><td></td><td></td></tr> 6<tr><td>, 12, 24웰 배양 플레이트</td><td>세포 배양에 적합한</td><td>모든</td><td></td> 시</tr><tr><td>아노아크릴레이트 슈퍼 접착제</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>에오신</td><td>머크</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr>태<tr><td>아 소 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>인서트 8um, 12웰 플레이트용</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>인서트 8um, 24웰 플레이트용</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>인서트 8um, 6웰 플레이트용</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td>Hepa 공기 여과</td></tr><tr><td>저융점 아가로스&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS 테트라졸륨 시약&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 플레이트 리더&nbsp;</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이</td>드 <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자</td> 평<td>평한 사각 팁이 있는 모든 것</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>수술용 가위</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비브라톰</td><td>라이카</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s Medium E, GlutaMAX 포함 (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

정밀하게 절단된 간 절편의 생산 및 배양을 위한 최적화되고 단순화된 기술

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

수확 시 장기의 신속한 처리를 보장하고 장기 손상을 방지하기 위해 동물의 관류를 의도적으로 생략합니다. 절개 후 간을 신속하게 추출하고 즉시 얼음처럼 차가운 장기 보호 완충액(예: Krebs 완충액24,29)에 넣습니다. 임베딩하지 않고 신선한 간 조직을 절단하는 것은이전에 설명되었지만1, 장기 보호 버퍼와 결합된 저융점 아가로스30(그림 1)에 간을 임베딩하면 진동체에서 최적의 절단 조건을 얻을 수 있어 조직 손상을 줄이고 절편 두께의 재현성을 높일 수 있습니다. 얇은 절편은 더 많은 세포층이 영양소와 산소에 접근할 수 있도록 하고31 세포 사멸을 줄이기 때문에 조직 두께가 중요합니다. 그러나 너무 얇은 단면은 균일하게 절단하기 어려워집니다. 반대로 400μm보다 두꺼운 슬라이스는 영양소의 침투율이 낮습니다. 절편을 인서트(그림 1)를 사용하여 액체-공기 계면에서 배양하고 셰이커에서 37°C에서 5%CO2 및 21%O2로 배양했습니다. 절편은 수확 후 3시간 이내에 배양 배지에서 배양해야 하며, 그 후 세포 사멸이 빠르게 발생합니다32.
PCLS의 생존력을 결정하기 위해 4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 분석으로 세포 생존율을 평가했으며, 이는 MTS를 줄이기 위해 NAD(P)H 의존성 탈수소효소, 즉 대사 활성 세포가 필요합니다.MTS 값은 각 슬라이스 가중치로 정규화되었습니다. PCLS 생존력을 최적화하기 위해서는 배양 24시간 후 생존력을 유지하기 위해 최소한의 배양 배지가 필수적이었습니다. 24개의 웰 플레이트에서 0.7mL의 부피는 12개의 웰 플레이트에서 1.5mL, 6개의 웰 플레이트에서 2.6mL에 비해 TMS 분석에 의한 생존율(p = 0.02)의 현저한 감소를 보여주었습니다(그림 2A). 이러한 볼륨은 섹션을 약간 덮을 수 있도록 선택되었지만 사용된 인서트 및 플레이트의 유형에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 다른33과 마찬가지로 12개의 웰 플레이트는 더 적은 양의 배양 배지 내에서 최적의 생존을 위한 최상의 절충안으로 사용됩니다.
진탕은 필수적이며 정적 배양에 비해 배양 후 24시간에 PCLS 생존율을 50% 증가시킵니다(그림 2B). 쉐이킹은 트랜스웰 사용으로 최적화된 중요한 공기-액체 계면을 생성하여 단면의 양쪽 면에 영양분과 산소에 접근할 수 있도록 합니다. 산소와 영양소의 흡수는 또한 트랜스웰 멤브레인을 통과하는 흔들림 운동에 의해 생성되는 일정한 흐름에 의해 증가합니다.
MTS 분석은 배양 1시간부터 배양 6일차까지 평가되었습니다. 세포 생존율은 배양 후 0일째부터 4일째까지 일정하게 유지된 후 6일째에 유의한 감소(p = 0.05)를 관찰했습니다(그림 2C). 헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 염색으로 평가한 PCLS 형태는 배양 후 최대 5일까지 담관 및 구조에 변화가 없는 것으로 나타났습니다(그림 3A-D). 0일(그림 3A)과 비교했을 때, PCLS는 배양 후 1일(그림 3B)과 2일(그림 3C)에 조직학적 차이를 보이지 않았으며, 핵 과색소증, 경미한 염증성 침윤, 배양 후 5일째에 중등도의 세포 사멸 과정을 선호했습니다(그림 3D). 종합하면, 이 PCLS 배양 프로토콜은 최소 4일 동안 생존력을 가능하게 하며, 이는 유사한 조건에서 절편을 사용한 연구와 일치합니다31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
그림 1: PCLS를 생성하기 위한 프로토콜을 요약한 회로도. 이 수치는34에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
그림 2: PCLS 배양의 최적화된 프로토콜은 5일 동안 만족스러운 생존력을 보여줍니다. (A) 세포 증식에 대한 웰 크기의 효과(n=3). (B) 세포 증식에 대한 진탕의 영향(조건당 n=6). (C) 배양 d0일에서 d6일까지의 간 절편에서 MTS 세포 증식 분석(시점당 n=5). OD 임의 단위로, 새로운 가중치를 슬라이스하도록 정규화됩니다. 그래프는 평균 ± SD를 보여줍니다. 짝을 이루지 않은 2-tailed 스튜던트 t-검정, ns=유의하지 않음, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. 이 수치는34에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
그림 3: 조직학 결과. (A-D) H&amp;E 염색 후 간 PCLS의 조직학의 대표적인 이미지. 눈금자 = 100μM. 이 수치는34에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

정밀하게 절단된 절편을 포함하는 유기형 1차 조직 이식 배양은 3차원(3D) 조직 구조와 천연 조직의 다세포 상호 작용을 나타냅니다. 이 비디오는 조직을 산소와 영양분에 간헐적으로 노출시킬 수 있는 시스템인 회전 배양 장치를 사용하여 쥐 폐 종양 유래 조직 절편을 배양하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 약물 반응 연구를 위해 정밀하게 절단된 폐 종양 절편을 생성하고 배양하는 방법론을 설명합니다.

폐 종양 조직 이식 배양: 정밀하게 절단된 폐 종양 절편을 생성하고 배양하는 절차

이 비디오에서는 고립된 인간의 폐를 아가로스로 팽창시키고 인간의 정밀하게 절단된 폐 절편을 준비하는 절차를 설명합니다. 준비된 체외 폐 절편은 추가 면역학 실험에 사용할 수 있습니다.

아가로스 기반 인체 정밀 절단 폐 절편 준비

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

이 프로토콜은 마우스에서 가능한 정밀 절단 간 조각의 생산을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. ex vivo 조직 샘플은 여러 날 동안 실험실 조직 배양 조건 하에서 유지될 수 있으며, 간 병리학을 검사하는 유연한 모델을 제공합니다.

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

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정밀하게 절단된 간 절편의 생산 및 배양을 위한 최적화되고 단순화된 기술

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