정밀하게 절단된 간 절편의 생산 및 배양을 위한 최적화되고 단순화된 기술

정밀 절단 간 절편(PCLS)을 생산하고 배양하는 프로토콜은 크게 다를 수 있습니다. PCLS의 주요 단점은 반감기가 짧다는 것이지만, 여기서는 최소 4일의 반감기를 보장하면서 비브라톰에 접근할 수 있는 표준 실험실 조건에서 PCLS의 생산 및 배양을 달성할 수 있음을 보여줍니다. PCLS는 시험관 내 모델과 생체 내 모델 사이의 격차를 메우는 매력적인 모델이지만 상대적으로 짧은 반감기로 인해 종종 무시됩니다. 그러나 그들은 대사 합산에 필수적인 모든 세포 유형과 보존된 구조를 포함하므로 전체 기관의 미니 모델과 유사하여 복잡한 표현형을 복제하면서 살아있는 조직의 연구 및 치료가 가능합니다. 연속 슬라이스는 매우 간단한 프로세스이지만 기술적으로 어렵습니다. 이를 용이하게 하기 위해 우리의 프로토콜은 절단 방향 및 조직 포매와 같은 주요 단계뿐만 아니라 배양을 위한 미니 모델 볼륨의 관련성 및 반감기를 늘리기 위한 동적 시스템에도 중점을 둡니다.

[해설자] 수확하기 전에 Krebs-Henseleit 완충액 1리터, 소독 및 냉각된 비브라톰 트레이, 고압멸균된 비브라톰 블레이드 및 4% 저융점 아가로스를 준비합니다. 수확 당일에는 녹인 아가로스를 사용할 때까지 섭씨 37도의 수조에 보관하십시오. 다음으로, 웰당 2.6, 1.5 및 0.7밀리리터의 완전 배지를 각각 6웰, 12웰 및 24웰 플레이트에 추가하여 배양 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 8마이크로미터 다공성 인서트를 삽입합니다. 플레이트를 5% 이산화탄소와 21% 산소가 포함된 섭씨 37도로 설정된 가습 인큐베이터에 넣습니다. 적절한 멸균 방법을 사용하여 수확에 필요한 모든 기구를 멸균하십시오. 안락사된 쥐의 복부에 70% 에탄올을 뿌려 해당 부위를 소독합니다. 멸균 겸자와 가위를 사용하여 복부 중앙에서 피부와 복막을 잘라 복강을 엽니다. 엽의 손상을 피하면서 주변 장기나 혈관에서 간을 부드럽게 절제하십시오. 그런 다음 간 전체를 얼음처럼 차가운 크렙스 완충액에 즉시 보관합니다. 뭉툭한 집게와 날카롭고 멸균된 칼 또는 가위를 사용하여 분리 중에 엽이 손상되지 않도록 각 엽을 개별적으로 분리합니다. 날카롭고 멸균된 칼을 사용하여 선택한 엽의 모든 가장자리를 다듬어 매립을 위한 직선적이고 관리하기 쉬운 가장자리를 만듭니다. 다음으로, 4% 저융점 아가로스를 젖은 얼음 위에 놓인 3cm 높이의 페트리 접시에 부어 고르게 식히고 엽이 가라앉는 것을 방지합니다. 아가로스를 30초 더 식힌 다음 다듬은 엽을 아가로스 중앙에 놓아 블록 중앙에 가라앉히도록 합니다. 그런 다음 아가로스 블록의 바깥쪽 가장자리를 잘라내고 접시에서 아가로스 블록을 제거합니다. 위쪽과 비브라톰 플랫폼에 접착된 면이 로브의 위쪽 가장자리와 평행한지 확인하십시오. 비브라톰을 5의 속도와 7헤르츠의 주파수로 250마이크로미터의 두께로 절단하도록 설정하는 것부터 시작합니다. 비브라톰을 멸균하고 트레이를 비브라톰 위에 올려놓은 후 얼음으로 주변을 둘러싸서 환경을 차갑게 유지합니다. 블레이드를 수평면에서 아래쪽 각도로 10도 각도로 설정합니다. 그런 다음 Vibratome 탱크에 얼음처럼 차가운 Krebs 완충액을 채웁니다. 플랫폼에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포하여 아가로스 블록을 장착할 준비를 합니다. 그런 다음 멸균 흡수성 조직을 사용하여 플랫폼에 접착할 아가로스 블록의 가장자리를 건조시킵니다. 이제 아가로스 블록을 Vibratome의 탈착식 플랫폼에 놓습니다. 간엽을 가로 절단할 수 있도록 수직으로 배치하면 간엽에 가해지는 압력이 줄어들고 절단이 더 부드러워집니다. 접착제가 굳을 때까지 1분 동안 기다렸다가 플랫폼을 Vibratome 탱크에 담그고 아가로스 블록이 Krebs 완충액으로 완전히 덮이도록 합니다. 절단을 위해 비브라톰을 프로그래밍하려면 시작 및 중지 위치를 설정하십시오. 그런 다음 간엽에 도달할 때까지 조각을 자르기 시작합니다. 주걱을 사용하여 간 조각을 수집하면 집게나 브러시와 달리 손상을 방지할 수 있습니다. 배양할 준비가 될 때까지 얼음처럼 차가운 Krebs 완충액에 슬라이스를 수집합니다. 주걱을 사용하여 간 조각을 배지와 삽입물이 들어 있는 준비된 웰로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 130rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 놓고 5% 이산화탄소와 21% 산소가 포함된 섭씨 37도의 기존 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다.