Name: 인간 아데노신 데아미나제 1 효소의 혈청 안정성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 배우세요 인간 아데노신 데아미나제 1 효소의 혈청 안정성 측정 방법을 통해 암 치료에서 단백질 바이오로직스의 약동학 프로파일과 치료 효능을 예측하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 단백질 공학 연구에 필수적입니다.

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1. 혈청 배양
<ol><li>최종 농도 10μM에서 1x PBS pH 7.4(1x PBS)로 HsADA1 10x 스톡을 준비합니다. 풀링된 인간 혈청 15mL 분취액을 해동하고 37°C로 사전 데웁니다. 1x PBS의 50mL 부분 표본을 37°C로 예열합니다.</li>
	<li>효소 + 혈청 혼합물이라고 하는 저결합 미세 원심분리 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 900μL의 합동 인간 혈청에 첨가하여 효소-혈청 배양 혼합물을 준비합니다. 별도의 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 10x HsADA1 스톡 100μL를 1x PBS 900μL에 추가하여 효소 + 1x PBS 혼합물이라고 하는 비혈청 대조군과 비교합니다. 각 혼합물에서 HsADA1의 최종 농도는 1μM입니다.</li>
	<li>100μL의 1x PBS와 900μL의 풀링된 인간 혈청으로 구성된 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 추가 대조군을 준비합니다. 이것은 효소 + 혈청 혼합물에 대한 비효소 조절 역할을 합니다. 또한 1mL의 1x PBS로 구성된 대조군을 만드십시오. 이것은 효소 + 1x PBS 혼합물에 대한 비효소 제어 역할을 합니다.</li>
	<li>1.2단계에서 각 혼합물 100μL를 별도의 저결합 튜브에 분취하고 1x PBS에서 30%(v/v) 글리세롤 100μL로 1:1로 희석합니다. 액체 질소로 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관합니다. 이 샘플은 Day 0 시점이 되며 해당 샘플의 HsADA1 농도는 500nM입니다. 1.3의 비효소 제어 혼합물에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 효소와 대조군 혼합물을 투명 필름으로 밀봉하고 37°C 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	<li>24시간 후, 배양된 각 샘플의 100μL를 분취액하고 1x PBS에서 30%(v/v) 글리세롤 100μL로 1:1로 희석합니다. 액체 질소로 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관합니다. 이 샘플은 1일차 시점입니다. 모든 효소 및 대조군 혼합물을 37°C 인큐베이터로 되돌립니다. 72시간 및 120시간에서 이 단계를 반복합니다. 참고: Aliquoted 샘플이 반드시 급속 동결될 필요는 없습니다. 또는 사용자는 각 샘플을 채취한 직후 마이크로플레이트 기반 분석을 수행할 수 있지만, 샘플을 테스트할 때마다 새로운 표준 곡선과 아데노신 기질 스톡을 준비해야 합니다.</li>
</ol>2. 마이크로플레이트 기반 분석
<ol><li>kinetic read 프로토콜(그림 2)을 설정하여 마이크로플레이트 리더를 준비하여 30분 동안 가장 짧은 판독 간격으로 260nm에서 흡광도를 측정하고 리더를 37°C의 설정값으로 예열합니다.</li>
	<li>수집된 모든 샘플을 얼음에서 해동합니다. 37°C로 사전 예열된 1x PBS를 저결합 마이크로 원심분리 튜브에서 희석제로 사용하여 해동된 각 샘플을 1:10으로 희석합니다. 이 샘플의 새로운 HsADA1 농도는 50nM입니다.</li>
	<li>비효소 혈청 대조군 샘플에서도 10x PBS로 희석합니다. 또한 50mL의 1x PBS에 66.8mg의 아데노신을 추가하여 5mM 아데노신 스톡을 준비합니다. 1x PBS 7,600 μL에 아데노신 스톡 400 μL를 첨가하여 아데노신 250 μM 희석액을 준비하고 인큐베이터에서 37 °C로 예열합니다.</li>
	<li>96웰 UV 호환 마이크로플레이트에 250μM 아데노신 희석액 160μL와 각 희석된 단백질 시료 40μL를 삼중으로 추가하여 총 부피 200μL를 만듭니다. 이것은 200 μM의 최종 아데노신 농도와 10 nM의 최종 효소 농도를 생성합니다.</li>
	<li>희석된 혈청 또는 1x PBS 대조군 40μL와 250μM 아데노신 희석액 160μL를 삼중으로 추가하여 대조군 샘플에 대한 희석을 반복합니다. 이것은 또한 200 μM의 최종 아데노신 농도를 생성하지만 효소는 없습니다. 참고: 먼저 모든 희석된 효소 및 대조군 샘플을 마이크로플레이트에 개별적으로 추가한 다음 12채널 마이크로피펫으로 아데노신 기질을 추가하여 총 로딩 시간을 줄이는 것이 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 단계에서는 플레이트 자체가 측정된 흡광도 신호를 혼동하지 않도록 UV 투명 플레이트를 사용해야 합니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 260nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
</ol>3. 마이크로플레이트 리더 데이터 분석
<ol><li>흡광도 데이터의 선형 영역의 기울기를 마이크로플레이트 데이터의 처음 몇 분 동안의 시간 함수로 결정합니다. 혈청으로 희석된 샘플의 경우, 이는 처음 ~120초에 해당합니다. 1x PBS 희석 샘플의 경우 이는 처음 ~ 270 초에 해당합니다. 이 흡광도 값 감소의 기울기는 음의 숫자 값을 가지며 초당 흡광도 단위(ΔA260/s)의 변화 단위를 갖습니다.</li>
	<li>효소 + 혈청 데이터의 기울기에서 풀링된 인간 혈청으로 구성된 음성 대조군의 기울기를 뺍니다. 1x PBS 대조군의 기울기를 빼서 효소 + 1x PBS 혼합물에 대해 동일한 작업을 수행합니다.</li>
	<li>수식 1을 사용하여 조정된 모든 기울기를 t=0h의 원래 기울기로 정규화하여 남아 있는 활동의 비율을 구합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">방정식 1</li>
	<li>시간 대비 남은 활동의 비율을 표시합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>HsADA1의 혈청 안정성 평가: 마이크로플레이트 기반 접근법

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아데노신&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT 마이크로플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind 마이크로센트리퓨지 튜브: 단백질&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>자체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청, 풀</td><td>MP 생물 의학</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hydroxy-kynurenine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosine&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>피리독살 5-인산 단수화물, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Wildtype Human Adenosine Deaminase 1</td><td>사내</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 아데노신 데아미나제 1 효소의 혈청 안정성 측정

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

그림은 야생형 HsADA1로 수행했을 때 실행된 분석 결과를 보여줍니다. 그림 3A,B는 아데노신 첨가 후 야생형 HsADA1에 대한 1x PBS/혈청-효소 혼합물에서 유래한 샘플의 260nm에서 흡광도 감소 곡선을 보여줍니다. 시간 데이터의 함수로 인한 이러한 흡광도 감소는 사용자가 마이크로플레이트 기반 분석을 성공적으로 완료했을 때 예상할 수 있는 것이며, 아데노신에 충분한 양의 기능성 HsADA1을 첨가한 후 발생하는 흡광도 데이터와 유사합니다. 그림 3C,D는 아데노신 첨가 후 효소를 포함하지 않는 테스트된 음성 대조군의 흡광도 곡선을 보여줍니다. 실제 효소 샘플과 비교했을 때, 이러한 음성 대조군의 흡광도 변화는 거의 무시할 수 있는 수준입니다. 그림 3에서 효소 곡선의 기울기가 배양 시간의 함수로 변하는 것을 볼 수 있습니다. 예를 들어 0일 시점의 기울기는 5일 시점보다 매우 가파릅니다.
그림 4는 37°C에서 1x PBS 또는 풀링된 인간 혈청에서 배양할 때 야생형 HsADA1에 의해 유지되는 활성의 비율을 시간 함수로 보여줍니다. 구체적으로, 그림 3A,B의 모든 흡광도 저하 곡선의 기울기는 해당 그룹의 Day 0 기울기로 정규화됩니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, 1x PBS와 풀링된 인간 혈청에서 야생형 HsADA1에 대해 유지된 활성에는 차이가 있습니다. 특히, 효소는 풀링된 인간 혈청에서 활성을 더 빨리 잃으며, 효소는 5일째에 원래 활성의 약 10%를 유지합니다. 효소가 활성의 약 75%를 유지하지만 HsADA1이 1x PBS에서 배양될 때 활성 손실은 여전히 감지할 수 있습니다. 이것은 Jennings et al.의 결과와 일치하며, 37 ° C에서 혈청으로 배양 한 후 48 시간6 후에 거의 40 % 활성이 감소했다고보고했습니다. Lu et al.은 또한 주변 온도(25°C)에서 흉막, 복막 및 뇌척수 체액에서 HsADA1 활성이 감소한다는 것을 보여주었습니다8.
이 프로토콜의 유연성을 입증하기 위해 우리는 이 프로토콜을 사용하여 이전에 HsKYNase66-W102H-T333N7이라고 불렸던 인간 기원의 또 다른 효소인 조작된 인간 키누레니나제 변이체의 혈청 안정성을 테스트했습니다. HsKYNase66_W102H-T333N은 야생형 HsKYNase 효소와 유사하게 OH-Kyn을 OH-AA로 전환하는 것을 효율적으로 촉매하지만, 실제로는 기질 특이성이 변경된 조작된 인간 키누레니나제 변이체의 2개 아미노산 복귀 돌연변이체, 즉 키누레닌을 안트라닐산으로 효율적으로 분해하는돌연변이입니다 7. OH-Kyn은 379nm에서 강하게 흡수하는 반면 OH-AA는 흡수하지 않으므로 OH-kyn 9,10에 엔지니어링된 HsKYNase 변형체를 추가하면 측정 가능한 흡광도 감소가 발생합니다. 그림 5A,B는 OH-Kyn을 첨가한 후 HsKYNase에 대한 1x PBS/혈청-효소 혼합물에서 유래한 샘플의 379nm에서 흡광도 감소 곡선을 보여줍니다. 그림 5C,D는 효소를 포함하지 않는 테스트된 대조군의 흡광도 곡선을 보여줍니다. HsADA1에서 볼 수 있듯이 시료 전반에 걸쳐 흡광도 곡선의 기울기에는 분명한 차이가 있습니다. 이는 그림 5A에서 특히 두드러지는데, 0시간 시점 기울기가 3시간 및 24시간 시점보다 훨씬 가파르기 때문입니다. 그림 6은 테스트된 HsKYNase에 대해 유지된 활성의 해당 비율을 시간 함수로 보여줍니다. HsADA1과 마찬가지로 HsKYNase66-W102H-T333N은 PBS보다 혈청에서 더 빨리 활성을 잃습니다(~85% 활성 손실 대 24시간 동안 ~40%). 이 효소 변이체의 혈청 안정성은 이전에 테스트되지 않았지만, 다른 HsKYNase 변이체와 마찬가지로 일반적인 경향을 따르며, 역시 37°C의 혈청에서 24시간 이내에 대부분의 활성을 잃었다7. 
일반적으로 효소는 pH, 염 농도, 온도 등을 포함한 다양한 요인으로 인해 시간이 지남에 따라 활성을 잃을 수 있습니다11. 따라서 이러한 추세를 따르지 않는 결과는 비정상으로 간주될 수 있습니다. 예를 들어, 효소 활성이 시간이 지남에 따라 급격히 증가하면 결과가 유효하지 않음을 나타낼 수 있습니다. 이것은 효소 조건이 변하지 않는다고 가정한 것이며, 우리는 엄격하게 시간 의미에서 말하고 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> 그림 1: HsADA1에 대한 프로토콜 단계를 자세히 설명하는 순서도. 그림은 이 프로토콜에서 수행된 단계를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> 그림 2: Microplate 리더 kinetic read 설정. 최소 간격으로 37°C에서 30분 동안 260nm에서 흡광도를 측정하기 위해 kinetic read 프로토콜이 만들어졌습니다. 그림은 이 프로토콜을 설정하기 위해 선택한 설정을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> 그림 3: 200μM 아데노신 첨가 후 HsADA1의 흡광도 대 시간 곡선. (A) 200μM 아데노신 첨가 후 혈청 배양 HsADA1의 흡광도 대 시간 곡선. (B) PBS 배양 HsADA1 1개. (C) 혈청 음성 대조군. (D) 1x PBS 네거티브 컨트롤(n =3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> 그림 4: HsADA1 활동 보존. 활성은 37°C에서 1x PBS 대 통합 인간 혈청으로 평가됩니다. 1x PBS에서 배양된 HsADA1에 대해 유지된 원래 활성의 비율과 5일 동안 통합된 인간 혈청을 측정했습니다(막대 = 평균 ± SD, n=3). 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정은 *p&lt;0.05, **p &lt; 0.01 및 ***p &lt; 0.001을 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> 그림 5: 400μM OH-Kyn 첨가 후 HsKYNase66-W102H-T333N의 흡광도 대 시간 곡선. (A) 400μM OH-Kyn 첨가 후 혈청 배양 HsKYNase의 흡광도 대 시간 곡선. (B) PBS 배양 HsKYNase 1개. (C) 혈청 음성 대조군. (D) 1x PBS 네거티브 컨트롤(n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> 그림 6: HsKYNase66-W102H-T333N 활동 보존. 활성은 37°C에서 1x PBS 대 통합 인간 혈청으로 평가됩니다. 1x PBS에서 배양된 HsKYNase66-W102H-T333N과 24시간 동안 통합된 인간 혈청에 대해 유지된 원래 활성의 비율을 측정했습니다(막대 = 평균 ± SD, n=3). 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정을 사용했습니다. P &lt; 0.001입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 아데노신과 이노신의 표준 곡선. 플롯은 0-200 μM에 대해 그려졌으며, 아데노신 또는 이노신을 언급된 농도의 1x PBS에 첨가한 다음 260nm에서 흡광도를 측정했습니다. (n=3)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: OH-Kyn의 표준 곡선. 플롯은 0-400 μM에 대해 그려졌으며, OH-Kyn을 언급된 농도의 1x PBS에 첨가한 다음 379nm에서 흡광도를 측정했습니다. (n=3)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 200μM 아데노신 첨가 후 HsADA1 농도 증가에 따른 260nm에서의 흡광도 대 시간 곡선. (A) 다양한 농도의 HsADA1에 대한 반응 곡선. (B) 1x PBS 컨트롤과 관련하여 흡광도 곡선의 선형 영역 기울기의 폴드 변화(막대 = 평균 ± SD, n=3). 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정은 **p &lt; 0.01 및 ****p &lt; 0.0001을 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 400μM의 OH-Kyn을 첨가한 후 엔지니어링된 HsKYNase의 농도가 증가함에 따라 379nm에서 흡광도 대 시간 곡선. (A) 엔지니어링된 HsKYNase의 다양한 농도에 대한 반응 곡선. (B) 1x PBS 컨트롤과 관련하여 흡광도 곡선의 선형 영역 기울기의 폴드 변화(막대 = 평균 ± SD, n=3). 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정은 ****p &lt; 0.0001을 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: 400μM의 OH-Kyn에서 열 비활성화 효소를 사용한 379nm에서의 흡광도 대 시간 곡선. 1x PBS에서 400μM의 OH-Kyn에 가열 비활성화 HsKYNase 효소를 첨가한 후 379nm에서 흡광도를 측정했습니다. (n=3)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

아세테이트 키나제 활동의 결정을위한 방법을 설명합니다. 이 분석은 다른 phosphoryl acceptors와 아세테이트 - 성형 방향으로 아세테이트 키나제 효소의 활동과 속도론을 결정하기위한 직접적인 반응을 활용합니다. 또한,이 방법은 다른 아세틸 인산 또는 아세틸 - COA 활용한 효소를 시금 활용하실 수 있습니다.

효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

이 문서 hydrophobically 수정된 Nafion의 효소 고정 막 방법과 멤브레인 내에 단백질 및 / 또는 효소를 고정하고 구체적인 활동을 테스트하는 방법을 합성을위한 절차를 설명합니다.

효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion

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