Name: Drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 Flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 눈 표현형을 ilastik과 Flynotyper로 정량화하는 계산적 방법을. 이 프로토콜은 수동 평가의 편향을 줄여 신경퇴행성 질환 연구의 정확성을 높입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila Eye 모델에서 Ommatidia의 편향되지 않은 정량화

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>컴퓨터 사양</td><td></td><td></td><td>Ryzen 5, 16GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>여기에서 소프트웨어 다운로드: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>오픈 소스 소프트웨어. Flynotyper 2.0을 사용하지 마십시오. 발표 당시 2.0은 상당히 새로운 것이었고 이 프로토콜은 Flynotyper의 원래 버전에 최적화되어 있습니다.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>여기에서 소프트웨어 다운로드: https://www.ilastik.org/download.html</td><td>오픈 소스 소프트웨어. 컴퓨터 운영 체제에 해당하는 Regular Builds에서 버전 1.4.0.post1을 다운로드하십시오.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>여기에서 소프트웨어를 다운로드하십시오 : https://imagej.net/ij/download.html</td><td>오픈 소스 소프트웨어. 버전 1.53 및 1.54가 사용되었습니다. 1.54는 업데이트된 버전이며 기본 다운로드입니다.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>z-stack 획득에 사용되는 시스템 및 소프트웨어.</td></tr><tr><td>DMC2900 카메라가 있는 Leica Z16 APO 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>텍스트에서는 Z-stack 현미경 및 카메라라고 합니다. 이 제품은 현재 보관되어 있습니다.</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

이전 연구에서는 이 프로토콜을 사용하여 전두측두엽 치매(ALS-FTD)를 동반한 근위축성 측삭 경화증과 관련된 돌연변이 VCP 단백질의 유전적 변형을 확인했습니다12. 또한, 이 방법은 구형 실체현미경13을 사용하는 경우에도S59L 매개 ALS-FTD CHCHD10 독성을 평가하기 위해 다른 논문에서도 사용되었습니다. 이러한 결과를 더욱 검증하기 위해 Baek et al.13과 동일한 ALS-FTD 질환 돌연변이에 ilastik과 Flynotyper를 사용했습니다. 그러나 훈련을 받지 않은 실험실 직원이 실험을 수행하여 유사한 결과를 얻었습니다. 따라서 ilastik과 Flynotyper를 결합하는 것은 Drosophila ommatidia의 변성을 편견 없이 점수화하는 강력한 방법입니다.
우리는 더 나은 정성적 평가를 가능하게 하기 때문에 링 라이트의 사용을 선호합니다(그림 3). 그러나 링 라이트를 사용하면 Flynotyper가 직접 분석할 수 없는 그림자가 발생합니다. 이를 극복하기 위해 Flynotyper로 P-Score를 정량화하기 전에 ilastik에서 이미지를 전처리했습니다. 전반적으로, 비퇴화(GMR-GAL4) 파리 눈의 P-점수는 중등도 퇴행된 눈(2x_S81L) 및 심하게 퇴행된 눈(3x_S81L)에 비해 유의하게 낮았습니다(그림 4A, B 및 표 1). 이는 Flynotyper에서 생성된 P-점수가 높을수록 눈이 더 퇴화되었음을 나타내기 때문에 예상되는 결과입니다1. ilastik을 사용하지 않았을 때, 퇴행되지 않은 눈과 적당히 퇴행된 눈 사이의 P-Score에는 무시할 수 있는 정도의 차이가 있었습니다(그림 4C 및 표 1). 이는 Flynotyper가 ilastik을 사용하지 않고 링 라이트 조건에서 옴마티디아 패턴을 정확하게 식별하는 데 어려움을 겪고 있음을 시사합니다. 이는 Flynotyper가 옴마티얼 중심1을 식별하기 위해 추가 조정을 통해 회색조로 변환된 이중 점 조명으로 촬영한 이미지를 사용하도록 설계되었기 때문입니다. Ilastik은 각 옴마티듐의 중앙에 점을 통합하여 이 프로세스를 복제하여 Flynotyper 내에서 정량화를 가능하게 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> 그림 1: ilastik 워크플로우의 예. (A) ilastik에서 새 프로젝트 생성. (B) 표준 이미지 선택. (C) Feature Selection에서 시그마 값 선택. (D) 민감도를 위해 옴마티디아의 전경을 표시합니다. (E) 민감성을 위해 옴마티디아의 배경을 표시합니다. (F) 소프트웨어가 처리된 파일을 내보내는 방법을 선택합니다. (G) 분석할 실험용 플라이 아이 이미지 선택. (H) 어떤 실험용 플라이 아이 이미지를 분석할 것인지 보여줍니다. (I) 소프트웨어 실행 후 완성된 제품. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> 그림 2: Flynotyper 워크플로우의 예. (A) 추가 분석을 위해 파리의 눈만 선택합니다. (B) 새 창에서 자른 눈 이미지를 엽니다. (C) 분석할 절단 이미지와 분석을 위해 확인할 매개변수를 선택합니다. (D) 예시 결과. 표현형 점수는 맨 오른쪽에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> 그림 3: 정성적 초파리 눈 이미지. 링 라이트(왼쪽)로 촬영한 동일한 플라이 아이와 퇴화되지 않은(위) 및 퇴화된(아래) 조건에서 듀얼 포인트 라이트(오른쪽)로 촬영한 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> 그림 4: Drosophila의 거친 눈 표현형을 정확하게 정량화하기 위해 Flynotyper 전에 ilastik을 사용합니다. (A) 퇴화되지 않은 눈(GMR-GAL4), 중등도의 퇴행성 눈(2x_S81L) 및 심하게 퇴행된 눈(3x_S81L)의 대표적인 초파리 눈 이미지. (B) ilastik 사용 후 Flynotyper의 정량 결과. 양측 치환 t-검정의 P-값은 결과의 해석을 용이하게 하기 위해 계산되었습니다(GMR-GAL4 대 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 대 3x_S81L: p = 0) (C) ilastik을 사용하지 않고 Flynotyper의 정량화 결과. 양측 치환 t-검정의 P-값은 결과 해석을 용이하게 하기 위해 계산되었습니다(GMR-GAL4 대 2x_S81L: p = 0.597, GMR-GAL4 대 3x_S81L: p = 0.687). 각 그룹에 대해 N = 3입니다. 데이터 포인트는 시각적 명확성을 위해 x축에 지터링되거나 누적됩니다. 수평 실선은 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-갈4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>ilastik 함유</td>
			<td>ilastik 미함유</td>
			<td>ilastik 함유</td>
			<td>ilastik 미함유</td>
			<td>ilastik 함유</td>
			<td>ilastik 미함유</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Flynotyper를 ilastik과 함께 사용할 때와 Flynotyper를 단독으로 사용할 때의 P-점수. 
추가 그림 S1: 이미지 획득을 위해 설정된 플라이 헤드 마운트. 이것은 여러 장의 용지를 사용하여 이미지 획득을 설정하는 방법의 예입니다. 그러나 머리와 플라이 아이의 올바른 방향을 보장하는 모든 방법을 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 기능 선택에서 시그마 값 2.5를 사용할 때 ilastik 및 Flynotyper의 정량적 결과. ilastik의 기능 선택에서 5.0 이외의 시그마 값을 사용하면 부정확한 정량화가 발생할 수 있습니다. 특히 시그마 값이 2.5이면 민감도가 손실됩니다. 양측 치환 t-검정의 P-값은 결과 해석을 용이하게 하기 위해 계산되었습니다(GMR-GAL4 대 2x_S81L: p = 0.192, GMR-GAL4 대 3x_S81L: p = 0). 각 그룹에 대해 N = 3입니다. 데이터 포인트는 시각적 명확성을 위해 x축에 지터링되거나 누적됩니다. 수평 실선은 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: 괴사성 패치로 인한 민감도 손실 및 부정확한 P-Score. 흰색 화살표는 괴사한 반점의 일부를 가리키고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S1: 기능 선택에서 시그마 값 2.5를 사용할 때의 P-점수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Drosophila melanogaster 눈 표현형 정량화: ilastik과 Flynotyper를 통합하는 계산적 접근 방식

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

quantifying-drosophila-melanogaster-eye-phenotypes-computational

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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