Name: 자연 살해 세포 유래 세포외 소포체 기반 암 바이오치료제를 생산 및 분리하기 위한 확장 가능한 바이오제조 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 자연 살해 세포 유래 세포외 소포체(NK-EV)의 확장 가능한 바이오제조 및 분리 방법을. 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 고순도 NK-EV를 생산하고 암 바이오치료제로서의 잠재력을 확인하는 전체 워크플로우를 익히세요.

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<meta charset="utf8"></head><body>NK-세포외 소포체의 바이오제조 및 특성화

<ol><li>Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell-based+immunotherapy+for+malignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell-based immunotherapy for malignant diseases.</a> Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).</li>
<li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+appetite+for+natural+killer+cells+intensifies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Industry appetite for natural killer cells intensifies.</a> Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).</li>
<li>Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+and+armed+natural+killer+cells+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment.</a> Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).</li>
<li>Elsharkasy, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems%3A+Why+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how.</a> Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).</li>
<li>St-Denis-Bissonnette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+extracellular+vesicles+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer.</a> Cancers. 14 (2), 451(2022).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28MISEV2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>St-Denis-Bissonnette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+large-scale+biomanufacturing+workflow+to+produce+natural+killer+cells+and+natural+killer+cell-derived+extracellular+vesicles+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy.</a> J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).</li>
<li>Federici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural-killer-derived+extracellular+vesicles%3A+Immune+sensors+and+interactors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors.</a> Front Immunol. 11, 262(2020).</li>
<li>Lugini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+properties+of+human+NK+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes.</a> J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alternatives+to+extracellular+vesicle-based+immunotherapy+-+exosome+mimetics+derived+from+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).</li>
<li>Cochran, A. M., Kornbluth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+the+human+natural+killer+cell+line+NK3.3+have+broad+and+potent+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).</li>
<li>Kim, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+human+natural+killer+cell-derived+exosomes+for+liver+cancer+therapy%3A+an+in+vivo+study+in+subcutaneous+and+orthotopic+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models.</a> Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).</li>
<li>Alvarez-Erviti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+siRNA+to+the+mouse+brain+by+systemic+injection+of+targeted+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).</li>
<li>El-Sahli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple-drug+nanotherapy+to+target+breast+cancer+cells%2C+cancer+stem+cells%2C+and+tumor+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature.</a> Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).</li>
<li>Sulaiman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-targeting+bulk+tumor+and+CSCs+in+clinically+translatable+TNBC+patient-derived+xenografts+via+combination+nanotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy.</a> Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).</li>
<li>Farcas, M., Inngjerdingen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-derived+extracellular+vesicles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy.</a> Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).</li>
<li>Murphy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-based+therapeutics%3A+natural+versus+engineered+targeting+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking.</a> Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>FiberCell-Systems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FiberCell+systems+user+manual+%26+quick+start+guide%22">FiberCell systems user manual & quick start guide</a>. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).</li>
<li>St-Denis-Bissonnette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+resazurin+phenoxazine+dye+as+a+highly+sensitive+cell+viability+potency+assay+for+natural+killer+cell-derived+extracellular+vesicle-based+cancer+biotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics.</a> J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).</li>
<li>Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+a+next-generation+drug+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform.</a> Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).</li>
<li>Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Federici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+release+and+low+pH+belong+to+a+framework+of+resistance+of+human+melanoma+cells+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin.</a> PLoS One. 9 (2), e88193(2014).</li>
<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Neviani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer-derived+exosomal+miR-186+inhibits+neuroblastoma+growth+and+immune+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms.</a> Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-derived+exosomal+miR-3607-3p+inhibits+pancreatic+cancer+progression+by+targeting+IL-26%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26.</a> Front Immunol. 10, 2819(2019).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+exosomes%3A+a+promising+drug+delivery+strategy+for+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease.</a> Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).</li>
<li>Dosil, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+%28NK%29+cell-derived+extracellular-vesicle+shuttled+microRNAs+control+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses.</a> Elife. 11, e76319(2022).</li>
<li>Geeurickx, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+use+of+recombinant+extracellular+vesicles+as+biological+reference+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material.</a> Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).</li>
<li>Nathani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+role+of+interleukin-15+stimulated+natural+killer+cell-derived+extracellular+vesicles+and+carboplatin+in+osimertinib-resistant+H1975+lung+cancer+cells+with+EGFR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations.</a> Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).</li>
<li>Gobin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow-fiber+bioreactor+production+of+extracellular+vesicles+from+human+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells+yields+nanovesicles+that+mirrors+the+immuno-modulatory+antigenic+signature+of+the+producer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+system+improves+the+yield+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+and+enhances+their+therapeutic+efficacy+for+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair.</a> Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).</li>
<li>Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+antibiotics+in+cell+culture+with+caution%3A+genome-wide+identification+of+antibiotic-induced+changes+in+gene+expression+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation.</a> Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).</li>
<li>Meng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+and+challenges+of+extracellular+vesicle-based+drug+delivery+system%3A+considering+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source.</a> Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+by+size-exclusion+chromatography+present+suitability+for+RNomics+analysis+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma.</a> J Transl Med. 19 (1), 104(2021).</li>
<li>Gamez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Sci Rep. 6, 33641(2016).</li>
<li>Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Dosing extracellular vesicles.</a> Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 & 마이크로; m 진공 여과 장치 Filtropur V50&nbsp;</td><td>사르스테트</td><td>83,3941,002</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m Acrodisc 주사기 필터&nbsp;</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MB9204560TF-LAB</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa Centricon Plus-70 원심 필터</td><td>Sigma</td><td>UFC701008</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 주사기&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플랫 클리어 바텀 블랙 폴리스티렌 TC-처리 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>코스타</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0491</td><td></td></tr><tr><td>AKTA 고속 단백질 액체 크로마토그래프&nbsp;</td><td>GE Lifesciences</td><td>29022094</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 바늘 - 18G</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 멀티모드 리더</td><td>BioTek&nbsp;</td><td>SH1M2G-SN</td><td></td></tr><tr><td>블루 주스 젤 로딩 버퍼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>CaptoCore 700 레진&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>17548102</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000 생존 능력 카운터&nbsp;</td><td>Nexcelom BioScience LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10 냉동 매체&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C2874</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&minus;/&minus; </지원>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 LED 블루/화이트 라이트 트랜스루미네이터&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LB0100</td><td></td></tr><tr><td>Duet P3202 플로우 컨트롤 펌프&nbsp;</td><td>FiberCell Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>엑</td><td></td>소좀 고갈 FBS P006EAAN <td></td>상업용 알코올</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A2720803</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>포도당 미터</td><td>AccuCheck</td><td>모델 930</td><td></td></tr><tr><td>HiScale 크로마토그래피 컬럼 10/40&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29360550</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF (GMP 매체 대체)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0956</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T 세포 확장 매체&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올&nbsp;</td><td>EMD</td><td>PX1834-1</td><td></td></tr><tr><td>K562 셀</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>LB 미디어&nbsp;</td><td>BioBasic</td><td>SD7002</td><td></td></tr><tr><td>L-Lactate 분석 키트&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65331</td><td></td></tr><tr><td>중공 섬유 카트리지&nbsp;</td><td>FiberCell 시스템</td><td>C2011</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma PCR 검출 키트&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab289834</td><td></td></tr><tr><td>나노사이트 NS300&nbsp;</td><td>맬번</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Supelco</td><td>SX0607N-6</td><td></td></tr><tr><td>NK92-MI 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-2408</td><td></td></tr><tr><td>pH 스트립-Mquant&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1,09533</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue HS 세포 생존력 시약 분석&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P50200</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 4 형광측정기&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q33262</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 어세이 튜브 스트립&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33252</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 플렉스 형광측정기&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 단백질 BR 어세이 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A50669</td><td></td></tr><tr><td>빠른 로드 1Kb 플러스 DNA 사다리&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SYBRSafe DNA 젤 스테인 Invitrogen</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프&nbsp;</td><td>하버드 장치</td><td>984730</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure TAE 버퍼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15558042</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain Acridine Orange 및 Propidium Iodide (AO/PI) 염색 용액&nbsp;</td><td>ESBE 사이언티픽</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

자연 살해 세포 유래 세포외 소포체 기반 암 바이오치료제를 생산 및 분리하기 위한 확장 가능한 바이오제조 워크플로우

Scalable Biomanufacturing Workflow to Produce and Isolate Natural Killer Cell-Derived Extracellular Vesicle-Based Cancer Biotherapeutics

NK-EV는 고유한 세포독성 기능을 가지고 있으며 다양한 암 모델에 대해 높은 효능을 입증되었습니다. 그러나 NK-EV의 대규모 생산에 적합한 바이오제조 워크플로우에 관한 현재 연구 중 더 많은 표준화가 필요합니다 6,21. 이전 연구에서는 고순도 NK-EV 제품을 대량으로 생산할 수 있는 폐쇄 루프 중공사 생물반응기(HFB) 시스템의 타당성을 설명했습니다7. 후속 조치로, 이 프로토콜 기반 연구는 바이오제조 워크플로우를 자세히 설명하고 NK-EV 제품을 생산 및 분리하여 재현성을 입증합니다(그림 1). 또한 제품 출시를 수행하기 전에 필수적인 제품 특성화 및 검증이 필요하며, 이를 통해 이 연구에서 새롭고 독창적인 데이터를 제시합니다.
HFB 시스템은 사용 편의성, 신뢰성, 확장성 및GMP 준수 7로 인해 NK-EV 생산을 위해 선택되었습니다. HFB 시스템 설정과 관련하여, NK 세포는 왼쪽 ECS 포트를 통해 주입되어 생물반응기 카트리지에 파종됩니다(그림 2). 동시에 미디어 병은 측면 포트를 통해 HFB에 연결되고 미디어는 시스템 전체로 흐를 수 있습니다. NK 세포는 무혈청, 무이종, 무공급, 무항생제 배지에서 배양되며, 포도당 함량이 50% 미만으로 떨어지면 배지를 교체하여 시간이 지남에 따라 세포 건강을 유지하고 극대화합니다. CM은 매일 수집되어 차동 원심 분리를 통해 처리되고 추가 처리가 준비될 때까지 동결(-80 °C)된 상태로 유지됩니다. 그 후, EV 분리는 UF 및 여과와 결합된 차동 원심분리 및 FPLC-SEC의 조합을 통해 수행됩니다(그림 3). 그 결과 최종 부피가 약 1.0 - 1.5 mL인 농축 멸균 NK-EV 제품이 생성됩니다. NK-EV의 FPLC-SEC 분리에 대한 대표적인 크로마토그램이 제공됩니다(그림 4). FPLC-SEC 처리 전에 NK-EV가 풍부한 CM을 엔도뉴클레아제로 처리하여 잠재적 숙주(NK) 세포 오염 물질인 dsDNA 수치를 크게 줄입니다7. 따라서 설명된 EV 분리 워크플로우는 NK-EV 제품에서 세포 파편과 RNA/DNA 오염 물질을 제거하며, 이는 낮고 원치 않는 면역원성 가능성을 보장하고 최종 제품이 다운스트림 연구에 적합한지 확인하는 데 필수적입니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig04.jpg"> 
그림 4: Fast Protein Liquid Chromatography 크기 배제 중에 생성된 NK-EV 분리 크로마토그램. 파란색 선은 흡광도(mAU, 최대 판독값 2000mAU)를 나타내고, 빨간색 선은 전도도를, 빨간색 텍스트는 실행 로그를 나타내고, 회색 음영 영역은 분수 T2 - T7로 표시)을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
분리 후 기본 NK-EV 특성화 및 품질 보증 테스트를 사용하여 추가 다운스트림 실험을 위해 NK-EV 제품을 출시할 수 있는지 평가합니다. NK-EV 제품의 입자 크기 범위 및 농도는 직경 76.30 - 174.30nm(D10 ± 78.38 ± 2.07nm, D50 106.72 2.43nm), D90 169.80 ± 4.17nm)의 크기와 평균 농도 1.39 x 1012 EVs/mL의 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 측정됩니다(그림 5A-B). 또한 형광측정기 정량화는 최종 제품에 대해 각각 298.90 ± 66.62 mg/mL 및 225.60 ± 37.7 ng/mL의 단백질 및 dsDNA 농도를 보여주었습니다(그림 5C-D). 이는 단백질 5.06 x 106 EV/μg과 DNA 6.16 x 1012 EV/μg의 평균 비율에 해당합니다. 미생물 및 마이코플라스마 검사는 모두 음성 결과를 나왔습니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는 이전 연구7에서 NK-EV의 특성화와 일치한다. 또한 이전 간행물7에서는 MISEV 가이드라인에 따른 NK-EV 제품(즉, TEM, 웨스턴 블롯, 내독소 수준, 바이러스 개체, 표면 항원 및 사이토카인에 대한 유세포 분석)에 대한 보다 심층적인 특성 분석을 제공합니다.
마지막으로, 백혈병 세포주 K562에 대한 NK-EV 치료 후 검증된 고감도 레사주린 기반 세포 생존율 분석을 사용하여 NK-EV 제품의 기능(즉, 암세포에 대한 세포 독성)을 평가했습니다 7,20. 3시간 동안 NK-EV를 사용한 K562 세포 처리는 9.33 x 109 EVs/mL의 EC50에 해당하는 세포 생존율에 대한 용량 의존적 효과를 생성했습니다(즉, 세포 집단의 50%를 사멸시키는 데 해당하는 용량; 그림 6A-B). 따라서 요약된 제품 출시 기준에 따라 NK-EV 제품은 추가 실험에 적합한 것으로 간주됩니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig05v3.jpg"> 
그림 5: 정제된 NK-EV 제품 특성화. (A) NTA로 측정한 NK-EV 제품 크기 분포는 각각 10회의 기술적 반복실험(5개의 비디오 캡처 x 2개의 희석)이 있는 5개의 독립적인 실험에서 얻은 평균으로 표시되었습니다. (B) NTA로 측정한 NK-EV 입자 생성물 농도(입자수/mL)는 5개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SD로 제시되었으며, 각각 기술적 중복이 있습니다. (C) NK-EV 생성물 단백질 농도(mg/mL)는 5개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 제시된 형광측정기를 사용하여 측정했으며, 각각 기술적 삼중수를 가졌습니다. (D) 형광측정기를 사용하여 측정한 NK-EV 제품 dsDNA 농도(ng/mL)는 5개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 제시되었으며 각각 기술적 삼중수를 가졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig06v3.jpg"> 
그림 6: 정제된 NK-EV 제품 기능 검증. NK-EV는 고감도 레사주린 기반 세포 생존율 분석을 사용하여 다양한 NK-EV 농도에서 3시간 동안 처리된 인간 K562 백혈병 세포에 대해 용량 의존적 세포 독성을 입증합니다. (A) 정규화된 분석 판독값(녹색 선은 처리되지 않은 K562 백혈병 세포 제어를 나타내고 검은색 점선은 용해된 K562 백혈병 사세포 제어를 나타냅니다. 세제 처리). 데이터는 기술적 삼중± 대한 11개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 SEM으로 표시됩니다. (B) 95% 신뢰 구간/예측 대역으로 NK-EV 처리를 위한 가변 기울기를 사용한 EC50 곡선 분석(빨간색 점선은 50% 응답을 나타냄). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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