Name: Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 학습하세요 생쥐 비장 조직에서 콜라게나제 I 소화와 초고속 원심분리를 이용한 엑소좀 분리 방법을. 이 기술은 세포막 무결성을 보존하며 심혈관 질환 및 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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샘플은 광동 의과대학 윤리위원회(Ethics Committee of Guangdong Medical University)의 윤리적 승인을 받은 쥐에서 채취한 것입니다. 이 프로토콜에 사용된 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 설명은 재료 표에 나와 있습니다. 추출 전 준비의 세부 사항은 그림 1에 나와 있으며, Spleen-Exo 추출 및 농축 과정은 그림 2에 설명되어 있습니다.
1. 준비
<ol>
	<li>고속 및 초고속 원심분리기를 4°C로 사전 냉각하고 데스크탑 쉐이커의 온도를 37°C로 설정합니다.</li>
	<li>그림 1A, B와 같이 세포 배양 접시(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100mm), 50mL 멸균 원심분리 튜브, 얼음 및 멸균 세포 여과기(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70μm)를 준비합니다.</li>
	<li>75% 알코올 스프레이를 사용하여 가위와 집게를 살균한 후 고온 살균합니다. 이러한 도구는 그림 1C에 나와 있습니다.</li>
	<li>얼음 위의 멸균 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">된 100mm 페트리 접시에 비장 조직을 놓고 1x 얼음 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 표면 혈액을 씻어냅니다. 멸균 거즈로 비장 조직을 건조시키고 건조 후 무게를 잰다. 알림: 티슈가 얼린 경우 계속하기 전에 얼음에 15분 동안 접시에 담아 해동하십시오.</li>
	<li>멸균 이송 피펫을 사용하여 70mL의 멸균 PBS를 스트레이너에 떨어뜨려 세포 여과기(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70μm)에 수분을 공급합니다.</li>
	<li>와류 믹서와 함께 0.1x PBS를 사용하여 소화 완충액(0.1% I형 콜라겐분해효소)을 준비합니다. 참고: 비장 조직 100mg당 10mL의 소화 완충액을 사용하십시오. 콜라겐분해효소 농도는 제품 지침에 따라 이 연구에서 선택되었습니다. 다른 조직 유형의 경우 연구자는 조직 밀도 및 구성에 따라 이러한 매개변수를 조정해야 할 수 있습니다. 각 조직 유형에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 다양한 농도와 소화 시간을 가진 예비 실험이 권장됩니다.</li>
</ol>
2. 조직 소화
<ol>
	<li>얼음 위에 담긴 배양 접시에 가위를 사용하여 조직을 균일한 작은 조각으로 자르고(그림 3A) 멸균 전사 피펫이 있는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>위와 같이 비장 조직 무게에 따라 튜브에 분해 완충액을 추가한 다음(그림 3B) 37°C의 수평 셰이커에서 45° 각도로 튜브를 흔듭니다. 소화 진행 상황을 모니터링하고 조직 덩어리가 분산되어 대부분이 모양을 잃었을 때 소화를 중지합니다. 소화 시간은 조직마다 달라야 합니다. 본 연구의 실험 조건에서 소화 시간은 약 30분입니다.</li>
	<li>분해된 혼합물을 실온(RT)에서 세포 여과기(Ф70μm)로 옮겨 섬유질 및 더 큰 조직 파편을 제거합니다. 알림: 분해 직후 여과를 완료하십시오.</li>
	<li>새로운 50mL 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.</li>
</ol>
3. 차등 원심분리에 의한 엑소좀 분리
<ol>
	<li>원심분리기는 4°C에서 10분 동안 500 x g 으로 여과합니다. 잔류 세포, 세포 파편 및 핵을 포함하는 펠릿은 그림 3C와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상층액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 20분 동안 3000 x g 으로 원심분리합니다. apoptotic body와 microsomes를 포함하는 펠릿은 그림 3D와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상층액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 30분 동안 10,000 x g 으로 원심분리합니다. 미세소포와 원형질막을 포함하는 펠릿은 그림 3E와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>생성된 상층액을 120,000 x g 에서 4°C에서 2시간 동안 초원심분리합니다. 펠릿은 그림 3F와 같이 원심분리 후 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 펠릿을 PBS로 세척한 후 다시 120,000 x g 에서 4°C에서 2시간 동안 초원심분리하여 엑소좀을 얻습니다. 펠릿은 그림 3G와 같이 원심분리 후 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다.</li>
	<li>분리된 엑소좀을 멸균 PBS(비장당 200μL)로 용해시키고 분리된 엑소좀을 -80°C의 새로운 2mL 원심분리 튜브에 보관합니다.</li>
</ol>
4. 투과전자현미경(TEM)에 의한 엑소좀 특성 분석
참고: TEM은 추출된 Exo가 소포 특성을 나타내는지 여부를 확인하는 데 사용되었습니다. 전자 현미경으로 식별된 Exo 샘플은 신선한 샘플이거나 4°C에서 짧은 시간 동안 잠시 보관해야 합니다.
<ol>
	<li>엑소좀(2-6 μg/μL)을 2% 전자 현미경(EM) 등급 파라포름알데히드로 RT에서 2시간 동안 고정합니다.</li>
	<li>엑소좀 용액 10μL를 구리 메쉬에 놓고 실온에서 10분 동안 배양한 후 멸균 증류수로 헹구고 여분의 액체를 흡수지로 닦아냅니다.</li>
	<li>구리 메쉬를 2% 우라닐 아세테이트로 1분 동안 염색하고 여과지로 과도한 액체를 닦아내고 백열등 아래에서 2분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>80kV에서 투과 전자 현미경으로 준비된 샘플을 관찰합니다.</li>
</ol>
5. 엑소좀의 크기 분포 및 입자 농도 측정
<ol>
	<li>표준 폴리스티렌 나노입자(250nm)를 나노 유세포분석기에 로드합니다.</li>
	<li>BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 Exo 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. BCA 단백질 분석 결과에 따라 엑소 샘플을 PBS로 희석(엑소좀을 1-10 ng/μL로 희석)한 다음 엑소 샘플을 나노 플로우에 로드하여 측면 산란 강도(SSI)를 측정합니다.</li>
	<li>표준 폴리스티렌 나노입자의 입자 농도에 대한 SSI의 비율에 따라 엑소 농도를 계산합니다. 참고: 크기 측정을 위해 그래디언트 크기(68nm, 91nm, 113nm, 155nm)를 가진 표준 실리카 나노입자를 나노 유세포계에 로드하여 표준 곡선을 생성합니다. Exo 샘플의 로드는 다음과 같습니다. Exo의 크기 분포는 표준 치료법에 따라 계산되었습니다.</li>
</ol>
6. 엑소좀 단백질의 용해 및 면역블롯 확인
<ol>
	<li>단백질 분석을 위해 엑소좀 펠릿에 100μL의 RIPA(radio immunoprecipitation assay) 용해 완충액을 추가합니다.</li>
	<li>소용돌이를 세게 하고, 파라필름으로 덮고, RT에서 20분 동안 흔들고, 그런 다음 다시 소용돌이칩니다.</li>
	<li>1000 x g 에서 30-60초 동안 잠시 원심분리하여 샘플을 수집하고, 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고, 분석할 때까지 -20°C에서 -80°C에 보관합니다.</li>
	<li>면역블롯의 경우 샘플을 5x 로딩 버퍼와 혼합하여 1x 농도를 달성하고 겔 전기영동을 준비합니다.</li>
	<li>전체 조직 균질화 제어가 필요한 경우, 위에서 설명한 대로 단백질 분해 효소 억제제와 함께 강력한 용해 완충액을 사용하여 조직을 용해합니다. 그런 다음 샘플을 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 나머지 세포외 기질, 전체 세포 또는 온전한 세포 파편을 버립니다.</li>
	<li>엑소좀 또는 조직 균질액이 포함된 시료 완충액을 95°C에서 5-10분 동안 끓입니다. 레인당 동일한 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 조직 균질화의 동등한 단백질을 통제로 적재하십시오.</li>
	<li>기존의 전기영동 버퍼를 사용하여 약 2시간 동안 80V의 전압에서 겔 전기영동을 진행합니다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 정제된 용해물에서 Exo 단백질 발현을 확인하고 분획에서의 상대적 Exo 함량을 비교합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Murine Spleen-Derived Exosome 분리를 위한 정제 기법

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<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
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<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>70 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Biologix Group Co., Ltd.미국</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 항체</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), 미국</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anti GM130 항체</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>안티 TSG101 항체</td><td>Abcam Plc, 영국</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, 중국</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, 중국</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., 미국</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 온도 조절 셰이커</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., 중국</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 완충액</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced BCA 단백질 분석 키트</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>흐름 나노 분석기</td><td>NanoFCM Inc., 중국</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>형광/화학발광 이미징 시스템&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., 중국</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP 염소 항 토끼 IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Molecular Devices, 미국</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Shanghai&nbsp; 의료&nbsp; 악기 (그룹)&nbsp;Co., Ltd., 중국</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 핀셋</td><td>상하이&nbsp; 의료&nbsp; 악기 (그룹)&nbsp;Co., Ltd., 중국</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro 원심 분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>안과 가위</td><td>상하이&nbsp; 의료&nbsp; Instruments (group)&nbsp;Co., Ltd., China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>안과 핀셋</td><td>상하이&nbsp; 의료&nbsp; Instruments (Group)&nbsp;Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 한외여과 원심분리기</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., 중국</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 완충액(강, 억제제 없음)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>룰</td>러 <td>델리&nbsp; 제조&nbsp; 회사, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Hitachi, Japan</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리관</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Buffer&nbsp;</td><td>무한 Servicebio Technology Co., Ltd., 중국&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of exosomes derived from mouse spleen tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

비장 유래 엑소좀(spleen-derived exosome)의 분리 및 정제 쥐의 비장 조직에서 엑소좀을 분리하기 위해 콜라겐분해효소 분해효소 분해와 차등 초원심분리를 조합했습니다(그림 2). 초기 단계에는 비장 조직을 전처리하여 표면 혈액을 제거한 다음 I형 콜라겐분해효소로 소화하는 것이 포함되었습니다. 이 효소 처리는 세포외 기질 구성 요소의 분해를 촉진하여 엑소좀을 온전하게 보존하면서 엑소좀을 방출했습니다. 분해 후, 일련의 원심분리 단계를 사용하여 세포 파편, 세포사멸체, 더 큰 소포를 순차적으로 제거했으며, 120,000 x g에서 상층액을 초원심분리하여 엑소좀을 펠릿화했습니다. 후속 분리 절차에서는 그림 3G와 같이 비장 유래 Exo가 농축된 PBS 용해성 펠릿이 수득되었습니다.
TEM 결과 분리된 엑소좀의 형태는 엑소좀의 특성을 연구하기 위한 표준 방법인 투과 전자 현미경을 사용하여 조사되었습니다. TEM은 일반적으로 엑소좀의 존재를 검증하고, 엑소좀의 품질을 평가하고, 엑소좀의 형태를 관찰하는 데 사용됩니다. TEM 이미지(그림 4A)는 엑소좀의 특징인 컵 모양의 소포의 존재를 보여주었습니다. 이 소포는 명확한 지질 이중층 구조를 나타내어 비장 조직에서 엑소좀이 성공적으로 분리되었음을 확인했습니다.
Spleen-Exo의 크기 분포 엑소좀의 크기, 분포 및 농도는 nano-flow cytometer를 사용하여 측정하였습니다. 결과(그림 4B)에 따르면 분리된 엑소좀의 직경은 30-150nm이며 최대 농도는 약 60nm입니다. 분리된 입자의 직경은 주로 50-80nm였으며 평균 입자 농도는 4.6 x 109 입자/mL였습니다. 이 크기 범위는 이전에 보고된 엑소좀의 특성과 일치하여 분리 프로토콜을 추가로 검증합니다.
웨스턴 블랏 분석 엑소좀 마커의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. Spleen-Exo 샘플에서 엑소좀 마커 TSG101 및 CD9가 검출된 반면, 음성 대조군으로 사용된 골지체 매트릭스 단백질인 GM130은 검출되지 않았습니다(그림 4C). 이에 비해 이들 마커의 단백질은 마우스의 비장 조직(Spleen-T)에서 발현되었습니다. 이는 분리된 엑소좀의 순도가 높았음을 나타내는데, 이는 엑소좀에 세포 오염 물질이 없었기 때문입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
그림 1: 공급 준비. (A) 50mL 원심분리기 튜브, 배양 접시, 얼음 및 수술 도구를 생물 안전 캐비닛에 넣었습니다. (B) 멸균 세포 스트레이너(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70μm). (C) 멸균된 수술 도구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
그림 2: Spleen-Exo 분리 절차. 비장 조직을 준비하고 얼음 PBS에서 작은 조각으로 자른 다음 Type I 콜라겐 분해 효소로 소화하고 지시된대로 원심 분리합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
그림 3: Spleen-Exo 분리의 대표 이미지. (A) 후속 소화를 위해 준비된 작은 비장 블록. (B) 소화 완충액이 있는 비장 조직 블록. (C) 500 x g 원심분리 후의 펠릿. (D) 3,000 x g 원심분리 후의 펠릿. (E) 10,000 x g 원심분리 후의 펠릿. (F) 120,000 x g 원심분리 후의 펠릿. (G) 120,000 x g 원심분리 후 엑소좀 펠릿. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
그림 4: Spleen-Exo의 식별. (A) 컵 모양의 형태를 가진 원형 또는 타원형 막소포로 분리된 입자를 보여주는 TEM 결과. 스케일 바 = 각각 200nm 및 50nm. (B) Flow Nano Analyzer에 의한 크기 분포 분석에 따르면 Spleen-Exo의 직경은 50nm에서 80nm까지 주로 다양하며 평균 입자 농도는 4.6 × 109 입자/mL입니다. (C) GM130의 음성 발현과 함께 Spleen-Exo에서 엑소좀 특이적 마커 단백질(TSG101 및 CD9)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. 이러한 마커는 마우스 비장(Spleen-T 그룹)에서 추출한 단백질 샘플에서 검출할 수 있었습니다. 대표적인 웨스턴 블롯 이미지를 보여주었습니다(n=6개 조직). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

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Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

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