3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

Mensah Lab은 혈관 연구에 중점을 두고 있으며 내피 글리코칼릭스와 혈관 질환에서의 역할을 연구하기 위한 새로운 기술을 개발하고 있습니다. 최근 개발에는 글리코칼릭스 연구를 위한 보다 발전된 시험관 내 모델을 만들고 내피 글리코칼릭스 건강 및 질병 복구를 표적으로 하는 치료 전략을 연구하는 것이 포함됩니다. 실험적 과제에는 건강한 글리코칼릭스를 정확하게 복제하지 못하는 불완전한 시험관 내 모델과 어려운 정량 및 측정 기술이 포함됩니다.

이 분야에 대한 우리의 현재 기여는 특히 암 전이, 손상된 글리코칼릭스의 재생 및 혈관 표면 수용체와의 상호 작용에서의 역할에서 내피 글리코칼릭스에 대한 현재의 이해를 확장했습니다. 우리의 방법은 기존 기술에 비해 더 잘 발달되고 생체모방적인 내피 글리코칼릭스를 발현하는 장기 온 칩 혈관 시스템을 만드는 저렴하고 효과적인 방법을 제시합니다. 시작하려면 50밀리리터 원심분리기 튜브에 실리콘 엘라스토머 베이스 10부의 무게를 잰다.

실리콘 엘라스토머 베이스가 들어 있는 튜브에 경화제 한 부분을 최종 부피 30밀리리터까지 붓습니다. 균일한 용액을 얻기 위해 철저히 혼합하십시오. 이제 잘 혼합된 용액을 금형에 부은 다음 금형을 진공 챔버에 넣어 30-60분 동안 또는 기포가 남지 않을 때까지 PDMS의 가스를 제거합니다.

탈기된 PDMS를 진공 챔버에서 제거하고 실온에서 48시간 동안 경화시킵니다. PLA 금형에서 경화된 PDMS를 추출합니다. 그런 다음 각 세포 배양 플레이트에 양면 테이프 두 장을 놓습니다.

다음으로, 각 PDMS 맥관 구조를 자체 세포 배양 접시의 테이프 위에 절반 놓습니다. 마이크로피펫을 사용하여 PDMS 맥관 구조를 따라 30마이크로리터의 피브로넥틴 방울을 여러 방울로 놓습니다. 필요에 따라 PDMS를 기울이고 피펫 팁을 사용하여 표면을 고르게 코팅합니다.

30분 배양 후 PDMS에서 피브로넥틴 용액을 흡인합니다. 그런 다음 캐비닛 내부에서 조각을 자연 건조시키십시오. PDMS 맥관 구조 반쪽의 양쪽 끝에 3D 프린팅 플러그를 배치하여 세포 현탁액 누출을 방지하고 조각당 두 개의 플러그를 사용합니다.

마이크로피펫을 사용하여 300마이크로리터의 HLMVEC 세포 현탁액을 각 PDMS 조각에 시드하고 배양합니다. 그런 다음 반쪽을 캐비닛에 다시 넣고 4개의 플러그를 제거합니다. HLMVEC 배양 배지를 첨가하여 PDMS 맥관 구조 절반을 잠기고 6-10시간 동안 다시 배양합니다.

이제 맥관 구조 절반을 포함하는 페트리 접시에서 HLMVEC 배지를 흡인합니다. 각 PDMS 절반을 폴리카보네이트 블록에 배치하여 올바른 정렬을 보장합니다. PDMS 맥관 구조의 끝 부분에 실리콘 실란트를 도포합니다.

하단 PDMS 조각의 양쪽 끝에 인치 길이의 튜브를 삽입합니다. 그런 다음 위쪽 PDMS 절반이 들어 있는 위쪽 아크릴 블록을 아래쪽 아크릴 블록으로 뒤집습니다. 아크릴 블록을 함께 볼트로 고정하여 나사산 블록이 바닥에 있는지 확인합니다.

3D 프린팅 플러그를 사용하여 튜브의 자유 끝을 막습니다. 플러그 하나를 제거하고 마이크로피펫을 사용하여 500마이크로리터의 HLMVEC 배양 배지를 맥관 구조에 부드럽게 주입합니다. 기울여 기포를 제거한 다음 플러그를 교체하십시오.

조립된 칩과 멸균 부품을 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다. 모든 튜브를 연결하고 흐름 시스템을 조립하여 입구 튜브가 주사기 저장소 바닥에 연결되어 중력 흐름을 촉진하도록 합니다. 이제 HLMVEC 배지로 유량 시스템을 부드럽게 프라이밍합니다.

50밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하십시오. 주사기 저장소 상단에 30밀리리터의 배지를 주입하고 연동 펌프를 저속으로 작동하여 튜브를 채웁니다. 각 PDMS 맥관 구조의 절반을 PBS에서 5분 동안 세척하고 혈관 절편이 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 용액을 추가합니다.

유체 시뮬레이션은 대조군 모델에 비해 전폐 절제술 모델의 혈관 분기점에서 상당히 높은 전단 응력을 보여주었습니다. 명시야 현미경은 24시간 후 분당 93.1밀리리터의 정적 및 흐름 조건 모두에서 균일한 HLMVEC 세포 부착을 확인했습니다. 입구 분기점의 형광 이미징은 대조군 및 전폐 절제술 모델 모두에서 온전하고 잘 분포된 세포층을 보여주었습니다.

두 번째 분기 직후 영상화는 대조군 및 전폐 절제술 모델 모두에서 상당한 세포 손실을 보여주었습니다. 세포는 부착된 상태를 유지했으며 두 모델 모두에서 두 번째 분기의 하류 영역에서 일관된 염색을 보였습니다. 혈관 모델에서 균일한 DAPI 염색 핵은 흐름 노출에도 불구하고 합류가 유지되었음을 나타냅니다.

초기 대조군 모델 시험에서는 시스템 프라이밍 중에 도입된 기포로 인해 세포 분포가 고르지 않게 되었습니다.