Name: Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: 배우세요 dd_PCR을 이용한 AAV 벡터 게놈 정량화 프로토콜로 정제된 샘플에서 바이러스 게놈 복제수를 정확히 측정하는 방법입니다. 이 표준화된 기법은 유전자 치료 연구와 임상 적용에서 신뢰성을 높입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>디지털 액적 PCR을 사용한 바이러스 게놈 정량을 위한 표준화된 프로토콜

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Gimpel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+process+and+product+characterization+of+recombinant+adeno-associated+virus-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 20, 740-754 (2021).</li>
<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
<li>Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobnik%2C+D+%22Front+Microbiol%22">Front Microbiol</a>. 10, (2019).</li>
<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8채널 피펫 10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>8채널 피펫 200 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>8채널 피펫 300 &마이크로; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>8-well PCR strip</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 터치 열 순환기 96&ndash; 딥 웰 반응 모듈</td><td>프로브용 Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 버퍼 제어 9 mL (2 x 4.5 mL)</td><td>프로브용 Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트(25개 패키지)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 액적 리더 오일(2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지 홀더</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100용 DG8 카트리지(24개)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100용 DG8 개스킷(24개)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I(10U/&micro; L) + 버퍼</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 물방울 생성 오일 (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. 필터 팁, 0.1-10 &mu; L, 34mm, 랙, PCR Clean, 멸균&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. 필터 팁, 20-300 &mu; L, 55mm, 랙, PCR Clean, STERILE&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. 필터 팁, 2-100 &mu; L, 53 mm, 랙, PCR Clean, STERILE&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>100 mM&nbsp에서 Forward 동결건조 프라이머 및 각각의 마스터 스톡;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP를 타겟 염기서열로 사용합니다. 앞으로 뇌관: 5' - GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'</td></tr> <tr><td>100 &micro에 Lyopohilized 조사 그리고 주된 주식; 남&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP를 타겟 염기서열로 사용합니다. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable (pkg of 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 non-ionic surfactant (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Honeywell 연구용 화학물질</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX 관리자 소프트웨어</td>, <td>ddPCR 데이터 분석을 위한</td><td>Bio-Rad</td><td></td> 소프트웨어</tr>, <tr><td>QX200 액적 발생기</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 판독기</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장용기</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>100 mM&nbsp에서 역방향 동결건조 프라이머 및 각각의 마스터 스톡;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP를 타겟 염기서열로 사용합니다. 역 프라이머: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'SafeSeal</td></tr> <tr><td>반응 튜브, 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA, 전단 (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td> 주문 시 프라이머 동반<td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

digital droplet polymerase chain reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 adeno-associated viral genomes 정량화

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

적절한 소프트웨어를 사용하여 결과를 시각화할 수 있습니다. 각 웰에 대해 1D 진폭 플롯은 해당 진폭을 기준으로 모든 물방울을 표시합니다. 양성 및 음성 비말 간의 명확한 구분이 예상됩니다. 전체 물방울의 10% 이상이 양수와 음의 물방울 구름 사이에 있는 경우(물방울 비라고 하는 현상) 샘플을 다시 측정해야 합니다( 그림 1 참조). 물방울 비에 대한 추가 정보는 토론에서 확인할 수 있습니다.
데이터 테이블을 생성하여 시료 이름, 허용된 액적 수(이벤트 수) 및 농도(copies/μL)를 포함하여 기록된 모든 정보를 요약할 수 있습니다. 이상적으로 이벤트 수는 15,000개에서 20,000개 사이의 허용되는 방울 사이여야 합니다. 우물에 대한 이벤트 수가 10,000 미만인 경우 데이터 점을 분석에서 제외해야 합니다. 출력 데이터의 예는 표 5에 나와 있습니다.
vg titer는 시료 희석을 고려하여 농도(copies/μL)를 기준으로 계산할 수 있습니다. dd_PCR의 작동 범위는 10-10,000 copies/μL이며, 10 copies/μL 미만의 값은 분석에서 제외해야 합니다. 샘플에 대한 vg 역가와 양성 및 음성 대조군을 계산해야 합니다. 포지티브 대조군의 측정값은 이론적 값에 비해 변동 계수(%CV)가 20% 미만이어야 합니다. 음성 대조군은 5 copies/μL 미만이어야 합니다. 또한 각 샘플에 대한 반복과 다른 희석 사이의 %CV를 계산해야 합니다. 서로 다른 희석 사이의 %CV가 20%를 초과하면 값이 부정확한 것으로 간주될 수 있으며 샘플을 다시 측정해야 할 수 있습니다.
성공적인 측정은 양성 및 음극 액적 구름의 명확한 분리, 최소 10,000개의 허용 액적, 10 copies/μL 및 10,000 copies/μL 사이의 값, 20% 미만의 반복 간 %CV를 특징으로 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> 그림 1: dd_PCR 방울의 시각화. (A) 1D 진폭 플롯은 양극과 음극 방울의 명확한 분리를 보여주며, 이는 성공적인 입자 분할을 나타냅니다. (B) 플롯은 물방울 비로 알려진 양수와 음의 물방울이 제대로 분리되지 않은 것을 보여주며, 이는 최적화되지 않은 분할 또는 분석의 잠재적인 문제를 시사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> 그림 2: 디지털 액적 PCR을 사용하여 바이러스 게놈을 정량화하기 위한 워크플로우. (1) 완충액, 시약 및 용액은 제조업체의 지침 또는 프로토콜의 1단계(스톡 용액 준비)에 따라 준비됩니다. (2) 45 μL의 DNase I 용액을 8-튜브 PCR 스트립의 각 튜브에 분주합니다. 샘플을 볼텍싱하고 간략하게 원심분리한 후 샘플의 5μL를 튜브 중 하나에 추가합니다. DNase I 및 시료 함유 8-튜브 PCR 스트립을 37°C에서 1시간 동안 열순환기에서 배양한 후 시료를 연속 희석합니다. (3) PCR 마스터믹스는 설명된 대로 제조하고, 19.8μL를 8-튜브 PCR 스트립의 각 튜브에 분주합니다. 2단계의 샘플 연속 희석액을 마스터믹스에 첨가합니다. 20 μL의 마스터믹스 플러스 샘플 용액을 카트리지의 중간 줄에 로드하고 60μL의 액적 생성 오일을 액적 생성 카트리지의 하부 웰로 옮깁니다. 그런 다음 카트리지를 액적 발생기에 넣고 지정된 조건에 따라 실행합니다. 액적 생성 후 카트리지의 맨 윗줄에서 42.5μL를 멀티웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. (4) PCR 플레이트를 PCR thermocycler에 로드하고 제공된 조건에 따라 실행합니다. 플레이트는 dd_PCR 판독기를 사용하여 분석됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 정밀도 데이터. 이 표는 각각 5가지 농도(QC1-QC5)를 가진 4개의 품질 관리(QC) 샘플 세트의 정밀 데이터를 제공합니다. 각 QC는 5 번 측정되었습니다. 반복성(A)을 나타내는 서로 다른 런 간의 변동 계수(%CV)와 중간 정밀도(B)를 나타내는 서로 다른 샘플 세트 간의 변동 계수(%CV)가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 샘플 희석. 표는 예상되는 바이러스 게놈 역가(vg/mL)를 기반으로 권장되는 샘플 희석을 보여줍니다. 최소 두 개의 값이 분석의 작업 범위 내에 포함되도록 하기 위해 총 3개의 희석이 권장됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: dd_PCR 마스터 믹스 구성. 이 표는 정방향 및 역방향 프라이머(909nM), 프로브(227nM) 및 프로브용 슈퍼믹스(dUTP 제외, 1x)를 포함하는 dd_PCR 마스터 믹스dd_PCR 구성을 간략하게 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 4: 열순환 조건. 표는 권장되는 PCR 프로그램에 대해 자세히 설명하고 있습니다: (1) 캡시드 파괴 및 효소 활성화를 위한 95°C에서 10분 배양, (2) DNA 변성을 위한 94°C에서 30초의 40 사이클, 어닐링 및 확장을 위한 60°C에서 1분, (3) 효소 비활성화를 위한 98°C에서 10분 배양, (4) 4 °C에서 유지. 어닐링 온도는 사용된 프라이머/프로브 세트에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 5: 실제 AAV 실행의 출력 데이터 예. 이 표는 실제 AAV 실행의 출력 데이터 예를 제공하며, 여기서 하나의 샘플은 각각 중복된 두 개의 서로 다른 희석으로 측정되었습니다. 바이러스 게놈(vg) 역가(vg/mL)는 10(DNase I 전처리) x 10(마스터 믹스에서 희석) x 1,000(μL to mL) x AAV 희석 완충액에서 희석 공식을 사용하여 계산됩니다. STDEV는 표준 편차를 나타내고 CV는 변동 계수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

quantification-adeno-associated-viral-genomes-purified-vector-samples

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연구

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Bioengineering

생명공학

모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

이 프로토콜은 작은 규모의 AAV 생산, 인트라비탈 주사, 망막 이미징 및 망막 게놈 DNA 격리와 함께 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환 효율을 정량화하는 방법을 제시합니다.

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

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재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

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여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

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