뉴캐슬 질병 바이러스 혈청학의 혈구 응집 억제 분석을 위한 항원 준비의 최적화

본 연구는 혈구응집억제 분석을 위한 항원 준비를 최적화하는 데 중점을 두고 있습니다. NDV 항체 검출 정확도를 높이기 위해 4-HAU 항원 용액을 빠르고 정확하게 준비할 수 있는 방법을 제공합니다. HI 분석은 NDV 항체 검출을 위한 가장 일반적인 방법으로 남아 있습니다.

그러나 자동화된 액체 처리 시스템, 고처리량 혈청학적 플랫폼 및 고급 이미징 도구를 포함한 새로운 기술도 HI 분석에 통합될 수 있습니다. 이를 통해 특히 큰 배치 크기를 처리할 때 더 빠르고 정확한 분석이 가능합니다. 당사는 항원 원액의 HA 역가를 보다 정확하게 검출하기 위한 효율적인 방법을 확립했으며, 엄격한 역적정 방법 및 잘 정의된 조정 프로세스와 결합했습니다.

이 접근 방식은 정확한 방법을 제공하고 계산 작업을 최소화하여 테스트 효율성과 신뢰성을 높이고 가금류 개체군의 질병 감시 및 통제를 개선하는 데 기여합니다. 닭 적혈구 현탁액과 HA HI 결과의 시각적 판독은 여전히 변동성에 기여합니다. 본 연구실에서는 RBC 현탁액을 표준화하고 HA HI 분석 결과를 디지털화하여 주관성을 줄이고 일관성을 향상시키기 위한 컴퓨터 비전 또는 기타 방법을 탐구하는 데 중점을 둘 것입니다.

먼저 3ml의 Alserver 용액을 멸균된 15ml 원추형 원심분리기 튜브에 추가합니다. 면역이 없는 닭 세 마리의 날개 정맥에서 각각 1ml의 혈액을 수집합니다. 그런 다음 수집된 혈액을 즉시 항응고제 튜브에 옮기고 반전으로 내용물을 부드럽게 혼합합니다.

튜브에 멸균 PBS를 채워 총 부피를 12ml로 만듭니다. 구성 요소가 고르게 분포되도록 용액을 부드럽게 혼합하십시오. 그런 다음 수평 로터가 장착된 원심분리기에 튜브를 넣고 500G의 원심분리기를 10분 동안 가열합니다.

원심분리 후 튜브에서 상층액과 백혈구층을 조심스럽게 제거합니다. 피펫을 사용하여 RBC 펠릿 1ml를 99ml의 멸균 PBS 용액에 넣고 1% RBC 현탁액을 준비합니다. 동결건조된 항원을 재구성하려면 이를 함유한 앰플에 2ml의 멸균 PBS를 첨가합니다.

앰플을 부드럽게 흔들어 내용물이 완전히 녹도록 한 다음 거품 형성을 최소화하기 위해 2-3분 동안 그대로 두십시오. 부분 표본은 용액을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 재구성하고 사용할 때까지 섭씨 영하 20도로 설정된 냉동고에 보관합니다. 먼저 40, 80, 120 및 160마이크로리터의 PBS를 일회용 96웰 V-바닥 마이크로타이터 플레이트의 인접한 4개의 웰에 각각 분배합니다.

재구성된 항원 20마이크로리터를 각 웰에 넣고 위아래로 10회 피펫팅하여 희석액을 생성합니다. 그런 다음 후속 단계를 위해 새 마이크로타이터 플레이트에 명확하게 라벨을 붙이고 25마이크로리터의 PBS를 1열에서 5열까지의 각 웰에 분배합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 희석된 항원 용액을 1열에서 5행까지의 첫 번째 웰에 넣습니다.

내용물이 균일하게 분포되도록 최소 5회 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 각 행의 첫 번째 우물에서 두 번째 우물로 25 마이크로 리터를 옮기고 완전히 혼합합니다. 11번째 열 이후 25마이크로리터의 최종 용액을 버립니다.

다음으로, 항원 농도가 가장 낮은 웰부터 시작하여 각 웰에 각각 25마이크로리터의 PBS와 1%닭 RBC 현탁액을 추가합니다. 마이크로타이터 플레이트를 마이크로플레이트 셰이커에 올려 완전히 섞습니다. 플레이트를 실온의 벤치탑에 약 30분 동안 그대로 두어 12번째 열의 적혈구가 완전히 가라앉을 수 있도록 합니다.

여기에 표시된 공식을 사용하여 4-HAU 항원 용액을 준비하기 위한 희석 계수를 계산합니다. 주어진 공식을 사용하여 필요한 4-HAU 용액의 총 부피와 항원 원액 및 PBS의 필요한 부피를 결정합니다. 피펫을 사용하여 계산된 PBS 부피를 용기로 옮깁니다.

해당 부피의 항원 원액을 넣고 완전히 혼합하여 4-HAU 항원 용액을 준비합니다. 그런 다음 25, 50, 75, 100, 125 및 150마이크로리터의 PBS를 마이크로타이터 플레이트의 인접한 6개 웰에 분배합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 4-HAU 항원 용액을 첨가하고 적절한 희석을 보장하기 위해 10회 위아래로 피펫팅합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 25마이크로리터의 희석된 각 항원 용액을 초기 열에서 다른 열의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 각 웰에 25마이크로리터의 PBS를 추가한 다음 각 웰에 25마이크로리터의 1% 닭 RBC 현탁액을 추가합니다. 마이크로 플레이트 셰이커에 플레이트를 약 20초 동안 올려 내용물을 완전히 섞습니다.

웰의 혈응집 패턴을 주의 깊게 관찰하고 결과를 기록합니다.