Name: 유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 전기천공법이 유도한 작용 전위 생성 변화를 광학 모니터링으로 분석하는 방법을. 유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포를 활용하여 흥분성 세포의 전기생리학적 특성 변화를 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>유전자 조작 스파이킹 HEK 세포에 대한 전기천공법 효과 평가

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr><tr><td>2-well Nunc Lab-Tek II 챔버 #1.5 독일 커버글라스 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155379</tr><tr><td>ADP305 차동 전압 프로브</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 전류 프로브</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린&nbsp;</td><td>시그마-알드리치/머크</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 모디피드 이글' s 중간 고포도당 성장 매체</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA</td><td>)potentiometric probes</td><td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>글루타민</td><td>시그마-알드리치/머크</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Ikra Pio&nbsp;</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치/머크</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로브로마이드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치/머크</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>펄스 발생기&nbsp;</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>참조 참조11</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25cm&sup2; 조직 배양 플라스크</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Tet-on 스파이킹 HEK 세포</td><td>American Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>Thunder Imager Live Cell system for fluorescence microscopy</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A 오실로스코프</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 조작 tet-on 스파이킹 hek 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

전기 펄스에 의해 트리거된 체 외 흥분성 세포의 TMV 변화는 이 프로토콜을 사용하여 광학적으로 모니터링할 수 있으며, 형광 신호를 분석하여 관련 매개변수를 추출할 수 있습니다.
실험 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 실험에 사용되는 100μs 전기 펄스의 일반적인 신호는 그림 1B에 나와 있습니다. 현미경 아래에 배치된 챔버의 세포는 일반적으로 그림 1C (명시야 이미지) 및 그림 1D (형광 이미지)의 세포와 비슷합니다. 우리는 2분마다 전압이 증가하는 전기 펄스가 동일한 셀에 적용되는 실험을 수행합니다. 2분의 인터펄스 시간은 특히 눈에 띄는 전기천공법과 관련된 가장 높은 진폭의 펄스를 사용할 때 세포막의 완전한 재밀봉 및 복구를 허용하기에 충분히 길지 않을 수 있습니다. 따라서, 펄스의 일부 누적 효과를 기대할 수 있습니다. 이러한 누적 효과를 피하기 위해 인터펄스 지연을 연장할 수 있지만, 테스트된 펄스 진폭의 수를 줄이고 셀을 현미경에 너무 오래 유지하는 것을 방지할 수 있습니다.
실험에서 형광 이미지를 캡처한 후 사용자 지정 MATLAB 응용 프로그램으로 분석할 수 있습니다. 먼저 픽셀 임계값을 결정합니다(그림 2A). 낮은 임계값을 조정하면 세포 주변의 멤브레인에 대한 선명한 이미지(보라색)를 얻을 수 있고, 높은 임계값을 조정하면 파편 신호(녹색)를 제거할 수 있습니다. 그런 다음 애플리케이션은 전달된 각 연속 펄스에 대한 모든 임계값 픽셀의 평균 형광 강도를 측정하여 형광 F/F0의 상대적 변화에 대한 시간 종속 신호를 얻습니다. 이 신호는 펄스가 적용되지 않은 제어 타임 랩스 기록에서 결정된 F의 선형 감소의 기울기를 빼서 염료 광표백을 위해 보정됩니다(그림 2B). 신호를 보정한 후 응답의 매개변수는 인앱 테이블과 보정된 형광 신호의 그래프 형태로 추출됩니다(그림 2C). 드문 경우지만, 알고리즘이 명백한 피크를 감지하지 못하거나 스퓨리어스 잡음 신호를 거짓양성(false positive)으로 검출합니다. 이러한 경우, 사용자는 형광 신호의 해당 지점을 피크로 수동으로 선택하거나 감지된 거짓 피크를 제거할 수 있습니다(그림 2D - 전기 펄스가 적용되기 전에 비정상적으로 감지된 작은 피크의 제거).
MATLAB 응용 프로그램을 사용하면 여기 가능한 S-HEK(그림 3A) 및 비여기 NS-HEK 셀(그림 3B) 모두에서 전기 펄스에 대한 TMV 반응 이미지를 얻을 수 있습니다. 피크 수(NoPeaks), 평균 피크 간 시간(두 개 이상의 피크가 검출된 경우, MPPT), 최대 응답(MR), 첫 번째 피크까지의 시간(TtFP) 및 피크에서 25%, 50%, 75% 및 90% 회복까지의 시간(각각 T25, T50, T75, T90)과 같은 응답 매개변수가 추출됩니다. 이러한 매개변수를 통해 서로 다른 전기 펄스에 대한 반응을 평가할 수 있으며(예: 서로 다른 E의 전기 펄스에 의해 트리거된 피크 수 결정, 그림 3C) 여기와 전기천공법 간의 상호 작용을 평가할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig01.jpg"> 
그림 1: 설정, 파형 및 S-HEK 셀. (A) 현미경 스테이지의 챔버 이미지. (B) 연구에 사용된 펄스의 파형의 예(시간 경과에 따른 전압(U)). (C, D) S-HEK 세포((C): 명시야, (D): 형광), 눈금 막대: 100μm의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig02v2.jpg"> 
그림 2: 데이터 분석 애플리케이션. (A) 애플리케이션 인터페이스의 이미지 - 임계값. (B) 형광 변화의 원시 및 보정된 신호의 그래프. (C) 응용 프로그램 인터페이스의 이미지 - 추출된 데이터. (D) 피크 검출의 수동 보정(전기 펄스가 적용되기 전에 비정상적으로 감지된 작은 피크 제거, 빨간색 화살표로 표시). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig03v2.jpg"> 
그림 3: 대표적인 결과. (A, B) (A) 서로 다른 진폭의 100μs 전기 펄스를 가진 (A) 흥분성 S-HEK 및 (B) 비흥분성 NS-HEK에서 TMV의 변화를 유발하는 것은 대표적인 실험의 결과입니다. 명확성을 위해 적용된 펄스 시퀀스에서 선택한 펄스에 대한 응답만 표시됩니다. (C) 서로 다른 진폭의 100μs 펄스에 의해 트리거된 TMV 응답의 매개변수: 예는 피크 수를 보여줍니다. 결과는 평균 ± SE, 실험 횟수 : N = 13으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>색인</td>
			<td>E-강점 (V/cm)</td>
			<td>피크 없음 (-)</td>
			<td>MPPT (영문) (밀리초)</td>
			<td>씨 (-)</td>
			<td>TTFP (밀리초)</td>
			<td>T25 (밀리초)</td>
			<td>T50 (밀리초)</td>
			<td>T75 (밀리초)</td>
			<td>T90 (밀리초)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>126</td>
			<td>9</td>
			<td>224</td>
			<td>0.104</td>
			<td>360</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>150</td>
			<td>6</td>
			<td>354</td>
			<td>0.097</td>
			<td>108</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>176</td>
			<td>2</td>
			<td>144</td>
			<td>0.089</td>
			<td>36</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>200</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.075</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
			<td>252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>250</td>
			<td>2</td>
			<td>396</td>
			<td>0.064</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>216</td>
			<td>432</td>
			<td>2052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.059</td>
			<td>0</td>
			<td>180</td>
			<td>1188</td>
			<td>2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>350</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.053</td>
			<td>0</td>
			<td>1008</td>
			<td>2340</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>400</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.047</td>
			<td>0</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 서로 다른 진폭의 100μs 펄스에 의해 트리거되는 TMV 응답의 매개변수.

유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

monitoring-electroporation-induced-changes-action-potential

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연구

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출처: Keener, D. G., et al. 마우스 해마 흥분성 및 클래스 특이적 억제 뉴런의 다양한 기관형 절편 배양에 걸친 단일 세포 전기천공. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 마우스 해마 절편 배양 내의 뉴런에 플라스미드 DNA를 도입하는 단일 세포 전기천공 과정을 보여줍니다. 이 절차에는 정확한 피펫 위치 지정, 압력 조정 및 전기천공 펄스가 포함되어 신경막을 일시적으로 투과시켜 유전자 전달을 촉진합니다. 전기천공 후, 슬라이스를 배양하여 도입된 관심 유전자의 발현을 가능하게 합니다.

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이 비디오에서는 형광 리포터와 융합된 광 의존성 이온 채널 단백질을 발현하는 배아 신장 세포 배양이 이온 이동에 대한 빛의 영향을 보여줍니다. 전체 세포 패치 클램프는 이온의 움직임을 모니터링하는 데 사용됩니다.

광유전학적 전기생리학: 빛에 의존하는 이온 채널을 가진 세포의 기록

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

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다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 세포 생존율과 일관되고 높은 처리량 전달을 결합합니다. 경상피 전기 임피던스(TEEI) 측정의 도입은 PSEP의 중간 프로세스에 대한 통찰력을 제공하고 무표지 전달을 가능하게 합니다. 이 기사에서는 PSEP 전달 실험과 TEEI 측정 분석을 동시에 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

이 프로토콜은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 분석을 위해 3차원 조직 모방 내에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 사용하여 계산 모델링을 사용하여 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 정량화합니다.

전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

학습하세요 전기천공법이 유도한 작용 전위 생성 변화를 광학 모니터링으로 분석하는 방법을. 유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포를 활용하여 흥분성 세포의 전기생리학적 특성 변화를 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

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