Name: IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 비효소적 외식 배양법을 통해 장기간 세포를 유지하는 방법을. 이 기술은 종양 세포 가소성 연구와 신경종양학 발전에 필수적인 자원을 제공합니다.

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여기에 사용된 종양 조각은 몽펠리에 대학 병원(CRB@chu-montpellier.fr)의 생물 자원 센터에서 관리하는 신선한 조직 샘플의 신경학 컬렉션의 일부입니다. 이 연구는 J. P. Hugnot 교수(프로젝트 번호. RECH/P722/1-5). 이 연구는 La ligue contre le cancer, ARC(Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA의 지원을 받았습니다. K.A.C는 멕시코 국립인문과학기술위원회(CONAHCYT)와 프랑스 뇌종양연구협회(ARTC)의 지원을 받고 있습니다.

본 프로토콜에 사용된 종양 조각은 환자의 동의를 얻어 윤리적으로 승인되고 특성이 잘 정의된 수집물로부터 확보되었습니다. 본 연구는 Gliomacult: 저등급 신경교종의 특성 분석 및 일차 배양(프로젝트 번호 RECH/P722/1-5)이라는 제목의 프로젝트 하에 수행되었으며, 2023년 8월 28일 종양 바이오뱅크의 과학 위원회로부터 승인을 받았습니다.
1. 배양 플레이트 준비
참고: 이 단계들은 무균 조직 배양 층류 후드 내에서 수행하십시오.
<ol>
	<li>배양 시작 최소 1시간 전에 poly-D-lysine (PDL) 및 laminin이 코팅된 24웰 플레이트를 준비한다.
	<ol>
		<li>최종 농도가 100 µg/mL이 되도록 10 mg의 PDL 분말을 100 mL의 붕산염 완충액(pH 8.4)에 희석한다. 완전히 용해되면 멸균을 위해 용액을 필터(0.22 µm)한다. PDL은 즉시 사용 가능하며, 3 mL씩 분주하여 -20 °C에 보관한다.</li>
		<li>겔 형성을 방지하기 위해 1-2 mg/mL laminin 튜브를 4 °C에서 해동한다. 50 µL씩 분주하여 -20 °C에 보관한다. 
		참고: 반복적인 해동 및 냉동은 피해야 한다.</li>
		<li>플레이트 코팅
		<ol>
			<li>선택 사항: 세포 배양 접시에 적합한 Ø 13 mm 멸균 커버스립을 24웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 배치한다. 
			참고: 이 단계는 이후 신경교종 이식편의 면역염색을 위한 것이다.</li>
			<li>웰 코팅을 위해 3 mL의 PDL 용액을 9 mL의 1x PBS와 혼합하고 50 µL의 laminin을 첨가한다. 코팅 농도가 1-2 µg/cm²가 되도록 이 용액 500 µL를 각 웰에 첨가한다. 코팅된 플레이트를 실온에서, 가급적이면 천천히 흔들어주며(15 RPM) 최소 1시간 동안 배양한다.</li>
			<li>배양 직전에 PDL-laminin 용액을 제거하고 멸균된 1x PBS로 2회 세척한다. 
			참고: 웰이 마르지 않도록 주의한다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 배지
<ol>
	<li>L-glutamine이 첨가된 DMEM/F12와 Vitamin A가 없는 N2 및 B27로 구성된 혈청 대체 혼합물이 포함된 지정 배지에서 IDH1 변이 외식편(explants)을 배양합니다. 박테리아 및 진균 오염을 방지하기 위해 ciprofloxacin, gentamicin, fungin을 포함한 항생제를 사용하십시오. 또한, 배지에 성장 인자인 heparin, EGF, FGF2를 첨가하고, 이를 여과(0.2 µm)하여 4 °C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 
	참고: 배지 성분 및 조제에 대한 자세한 내용은 표 1과 재료 표를 참조하십시오.</li>
</ol>
3. 절편 준비
<ol>
	<li>시료 처리 전, 그림 1A에 표시된 대로 작업 공간과 멸균 도구를 준비합니다. 쿨팩에 70% 에탄올을 분사하여 소독합니다. 가위와 핀셋은 70% 에탄올에 담갔다가 PBS로 헹구어 멸균합니다.</li>
	<li>수술적 절제 후 가급적 2 h 이내에 종양 절제편을 배양을 위해 얼음 위에 신속하게 옮깁니다(그림 1B). 
	참고: 더 나은 결과를 얻기 위해 종양 시료의 직경은 최소 9-10 mm여야 합니다. 조직학적 목적을 위해 이 방법에서는 배양액 없이 조직을 운송하는 것이 권장됩니다. 액체가 없으면 급속 냉동 시 얼음 결정 형성을 방지하여, 추후 조직학적 검사가 필요한 경우 조직의 무결성을 보존할 수 있습니다.</li>
	<li>종양 표본이 담긴 배양 접시를 쿨팩 위에 놓고 1X PBS로 가볍게 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다.</li>
	<li>절제된 종양은 종양 덩어리, 침윤 조직 및 비종양 성분을 포함하여 크기가 크고 이질적인 경우가 많습니다(그림 1C). 종양 세포 분리를 위해서는 종양 세포가 더 많이 포함되어 있을 가능성이 높은 회색을 띠며 부드럽거나 젤 같은 질감을 가진 부분을 선택합니다. 반대로, 배양에 적합한 종양 세포가 적을 수 있는 딱딱하고 하얀 부위(그림 1D)와 전기 소작의 결과로 인해 분석 결과가 부정확할 수 있는 검게 변한 부위는 피합니다.</li>
	<li>선택한 시료를 세절을 위해 1.5 mL 마이크로튜브 또는 크라이오바이알로 옮깁니다. 1.5 mL 마이크로튜브 또는 크라이오바이알에 멸균 배지 1 mL를 추가하고, 멸균 가위로 시료를 잘게 다져 작은 조각(1-2 mm3)이 될 때까지 자릅니다. 
	참고: 일반적으로 1-2 mm3 크기의 아주 작은 조각을 얻으려면 약 1-2분 동안 세절하는 과정이 필요합니다(그림 1E).</li>
	<li>멸균 가위를 사용하여 파란색 1,000 µL 피펫 팁의 끝부분을 조심스럽게 잘라 지름 약 3-4 mm의 넓은 입구를 만듭니다. 이렇게 수정된 팁을 사용하여 세절된 조직 조각 50-200 µL를 피펫팅하여 각 웰에 고르게 분배합니다. 작은 조각들은 빠르게 가라앉는 경향이 있으므로, 각 웰의 현탁액을 부드럽게 다시 균질화하여 균일하게 분포하도록 합니다. 
	참고: 과밀 상태가 되지 않도록 주의하고, 각 웰에 너무 많은 수의 조각을 넣지 않아 균형을 유지합니다(그림 1F).</li>
	<li>종양 조각을 37°C, 5% CO2, 100% 습도의 인큐베이터에서 배양합니다. 종양의 대사 활동(배지의 급격한 황변으로 확인) 및 각 웰의 조각 수에 따라 매일 배지를 교체합니다. 배지를 교체할 때는 200 µL 팁이 장착된 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡입함으로써 부착된 종양 조각이 떨어지지 않도록 주의합니다.</li>
</ol>
<img alt="종양 조직 준비 과정; 장비 설정; 조직 샘플; 원심분리 결과; 분석 차트." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 종양 절편 배양 절차. WHO 2021 분류에 따라 grade II 성상세포종(astrocytoma)으로 진단된 44세 환자로부터 미만성 저등급 신경교종 절제 조직을 얻었다. 해당 종양은 IDH1 변이(Exon 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His)와 TP53 변이(Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis)를 보였으며, ATRX 염색은 음성이었다. TERT 유전자의 Ets/TCF 결합 부위(C250T 및 C228T)에서는 변이가 검출되지 않았다. (A) 작업 표면은 쿨팩으로 구성되어 샘플의 변성을 최소화하고 생물학적 구성 요소의 생존력을 유지하는 환경을 제공한다. 이러한 주의 사항은 조직의 품질과 무결성을 보존하는 데 중요하다. (B) 병원에서 실험실로의 샘플 운송은 얼음 위에서 이루어져야 한다. (C) 종양 절제 조각. 화살표는 배양에 가장 적합한 부분을 나타낸다. (D) 분쇄할 가장 적절한 부위를 선택하기 위해 종양 박리가 수행된다. 본 연구진의 경험에 따르면, 백질은 일반적으로 성공적인 절편 배양을 생성할 가능성이 낮다. (E) 가위로 기계적 분쇄를 거친 후 15 mL 튜브에 담긴 직경 약 1-2 mm³의 종양 조각들. (F) 적절한 파종(seeding)에 필요한 종양 조각의 수가 24-well 플레이트의 웰별로 표시되어 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 다진 종양의 동결 보존 및 해동
참고: 냉동 보존은 오염이나 외식물 배양 손실에 대비한 백업을 확보하거나, 추후에 종양 샘플을 처리하기 위해 수행합니다.
<ol>
	<li>동결 보존: 세포 배양액 8 mL에 DMSO 2 mL를 추가하여 동결 매질(20% v/v DMSO 용액)을 준비합니다.</li>
	<li>세절된 종양 현탁액 1부피와 20% DMSO 동결 매질 동일 부피를 혼합하여 DMSO 최종 농도를 10%로 맞춥니다. 혼합물이 충분히 섞이도록 파이펫으로 조심스럽게 상하 혼합한 후, 약 1 mL씩 크라이오바이알에 분주합니다.</li>
	<li>크라이오바이알을 급속히 극저온 용기에 옮겨 온도를 점진적으로 낮춘 후, -80 °C에서 하룻밤 동안 배양하고 최종적으로 액체 질소에 보관합니다. 
	참고: DMSO와 같은 일부 동결 보호제는 세포가 상온에서 필요 이상으로 장시간 노출될 경우 유해할 수 있으므로, 세포를 동결 매질에 넣은 직후 이 단계를 수행해야 합니다.</li>
	<li>해동: 액체 질소에서 크라이오바이알을 꺼내어 세포의 약 80%가 해동될 때까지 즉시 37 °C 항온수조에 넣습니다.</li>
	<li>DMSO를 제거하기 위해, 미리 데워둔 1x PBS 5 mL가 들어 있는 15 mL 원심분리 튜브에 현탁액을 빠르게 파이펫팅하여 옮긴 후, 300 × g 에서 5분간 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 1X PBS로 세척한 후 원심분리(단계 4.5)를 반복합니다. 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입 제거하고, 적정량의 배지를 추가하여 미리 코팅된 PDL-Laminin 24-well 플레이트로 옮긴 후 배양기에 넣습니다.</li>
	<li>24시간 후 세포 부착 여부를 확인합니다. 며칠 후, 배양액을 교체하여 부착되지 않은 파편들을 제거합니다.</li>
</ol>
5. 배양 세포의 계대 배양
참고: 일단 조직편이 정착되면, 비디오 현미경 관찰이나 면역 염색에 사용할 수 있습니다. 또는, 종양 세포가 조직편 밖으로 이동하여 건강한 상태로 보인다면, 효소 분해를 통해 조직편을 계대 배양한 후 추가 실험을 위해 웰에 다시 파종할 수 있습니다. 하지만 본 프로토콜은 반복적인 계대 배양을 위해 설계된 것이 아니라는 점에 유의하십시오. 일반적으로 종양 세포가 노화되거나 사멸하기 전까지 단 한 번의 계대 배양만 시도할 수 있습니다. 모든 조직편 배양이 성공적으로 계대 배양되는 것은 아닙니다.
<ol>
	<li>계대 배양을 위해 기존 배지를 제거하고 1X PBS로 세척한 뒤, 웰에 0.05% trypsin-EDTA (125 µL)를 넣고 37 °C에서 3-4분 동안 배양한다. 그 후 Trypsin Inhibitor 6.5 µL, 20 mM CaCl2 12 µL (최종 희석 농도 2mM), DNAse I 1 µL를 추가한다. 
	참고: 해리에 필요한 배양 시간은 배양 상태에 따라 다를 수 있다. 최소 3분 후에 세포가 떨어졌는지 확인하는 것이 중요하다. 일반적으로 외식물(explant)이 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리되지 않고 작은 클러스터가 남아 있을 수 있으며, 이는 새로운 외식물 배양을 생성할 수 있다.</li>
	<li>p1000 파이펫을 500-600 µL로 설정하여 부드럽게 피펫팅하여 외식물을 분산시킨다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의한다.</li>
	<li>1x PBS 5 mL를 추가하고 300 × g에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 미리 데워둔 신선한 배지에 재현탁한 후 접종을 위해 세포 수를 측정한다.</li>
	<li>위상차 현미경으로 분열 중인 세포를 관찰하여 세포주 생성 가능성이 있는 배양물을 식별한다. 그림 2A에 나타난 바와 같이, 이러한 분열 세포는 일반적으로 둥근 형태를 띠며 염색체가 관찰된다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

IDH1 돌연변이 저등급 신경교종의 인비트로(in vitro) 및 전임상 모델을 개발하는 것은 이러한 종양의 느린 성장 속도와 IDH 돌연변이로 인해 발생하는 광범위한 게놈 및 후성유전체 변화를 재현하는 복잡성으로 인해 특히 어렵습니다. 더욱이, 이러한 침윤성 종양 세포는 면역 세포, 내피 세포, 교세포 및 신경 세포를 포함한 주변 세포들과 활발하게 상호작용하며, 생존을 위해 이들에게 의존할 가능성이 있습니다. 이러한 복잡한 상호작용은 실험실 환경에서 재현하기 어렵습니다.
IDH1 변이 저등급 신경교종에 대한 새로운 생물학적 통찰력을 밝히고 혁신적인 치료제 개발을 촉진하기 위해서는 인간 질병의 복잡성을 충실히 재현하는 모델을 구축하는 것이 필수적입니다. 교모세포종과 같은 고등급 신경교종에 비해, 현재 IDH 변이 신경교종에 사용할 수 있는 in vitro 모델은 상대적으로 적습니다. 대부분의 IDH1 변이 세포주는 역형성 희소돌기아교종(예: BT260 및 BT23...

미만성 신경교종은 가장 흔한 원발성 뇌종양입니다. 이 종양은 매우 강도 높은 치료(수술, 방사선 및 화학 요법)에도 불구하고 현재 치료가 불가능합니다.1. 신경교종 형성이 뇌에 거주하는 성체 줄기 또는 신경교전구세포에서 유래한다는 가설을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있습니다2. 교모세포종이 가장 공격적인 유형이지만, 미만성 저등급 신경교종(DLGG, 2등급 종양)도 널리 퍼져 있습니다(미만성 신경교종의 15%)1,3. DLGG는 천천히 성장하고 백질 관을 따라 이동하는데, 이는 이 '확산' 신생물의 특징4입니다. 이러한 DLGG는 치료에도 불구하고 재발하는 경우가 매우 많아 결국 높은 등급의 악성 종양(3등급 및 4등급)으로 진행됩니다5.
DLGG는 isocitrate dehydrogenase 1 또는 2 유전자(IDH1 또는 IDH2)의 missense 돌연변이를 특징으로 하며, 이로 인해 온코메타볼라이트 2-하이드록시글루타레이트(2HG)가 비정상적으로 생성됩니다. 이것은 후성유전학적 장애를 통해 세포 분화를 방해합니다.regulations6. IDH1 돌연변이 신경교종은 더 아형으로 분류됩니다: 성상세포종은 일반적으로 ATRX 및 P53에 돌연변이가 있는 반면, 희소돌기아교종은 1p19q deletions7을 특징으로 합니다. 이러한 종양은 종양 세포의 이질성을 나타냅니다. 단세포 RNA 염기서열분석 및 면역 분석은 이러한 종양 내에서 줄기세포 유사, 성상세포 유사 및 희소돌기아교세포 유사 표현형을 나타내는 다양한 종양 세포 집단을 밝혀냈습니다8,9.
쉽게 구할 수 있는 장기 배양 및 세포주의 이점을 누리는 교모세포종과 달리, IDH1 돌연변이 종양을 조사하기 위해 맞춤화된 세포 도구가 현저히 부족합니다1. 이는 치료제 개발을 진전시키고 IDH1 돌연변이 신경교종 형성 및 질병 진행에 대한 이해를 심화하는 데 중요한 장애물이 됩니다. 전통적인 혈청 성장 세포주는 오랫동안 사용되었지만 원래 종양을 부적절하게 복제하여 변형된 전사 프로파일을 나타냅니다. 또는 2D 또는 3D 종양체 모델에 관계없이 무혈청 배양 조건은 종양 세포의 전사 프로필과 생체 내 표현형(예: 정상 뇌 조직으로의 침입)을 보다 효과적으로 보존합니다10,11.
또한 환자의 수술 표본에서 파생된 단기 세포 배양은 종양의 분자 프로필과 세포 다양성을 보존하므로 세포주에 비해 종양의 생물학적 특성을 더 잘 나타낼 수 있습니다12. 본 연구에서는 신경교종 연구 및 치료제 개발을 위한 개선된 in vitro model의 필요성을 해결하기 위해 IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종 배양을 신선 또는 냉동 환자 절제술에서 유래한 외식식물로 배양하는 간단한 비효소적 방법을 소개합니다. 또한 IDH1 돌연변이 세포주를 유도할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td></td><td>556604 희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA001906</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Fujifilm Wako 항체</td><td>019-19741</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-IDH1 (R132H) 마우스 단클론 항체</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556003</td><td>딜리투이온 1:1000</td></tr><tr><td>안티 올리그1</td><td>R& D 시스템&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>희석 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50개), 비타민 A 뺀</td><td>값 Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>세포 동결 용기, 12 x 1 mL 또는 2 mL 극저온 바이알용</td></tr><tr><td>커버 슬립 &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; 보조&거래;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 글루타민 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>시그마-알드리치</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24-웰 클리어 플랫 바텀</td><td>Corning&reg;</td><td>353047</td><td>TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균&nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Serum acrodisc 37 mm 주사기 필터 GF/0.2 &micro; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>직선 광시야 형광 현미경</td></tr></tbody></table>

idh1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

가장 흔한 원발성 뇌종양인 미만성 신경교종은 조직병리학적 기준과 유전적 돌연변이에 따라 낮은 등급과 높은 등급으로 분류됩니다. 미만성 저등급 신경교종은 하위 집합을 구성하며, 주로 젊은 성인을 괴롭히고 높은 등급의 신경교종에 걸리기 쉽습니다. 미만성 저등급 신경교종에는 성상세포종(astrocytomas)과 희소돌기아교종(oligodendrogliomas)의 두 가지 주요 유형이 있으며, 각각 뚜렷한 유전적 및 조직학적 특징에 의해 정의됩니다. 이러한 종양은 특징적으로 대사 효소 IDH1의 돌연변이 변이를 보여 세포 분화를 방해합니다. 이들은 이질성이며, 증식성 줄기세포와 더 분화되고 정지된 신경교세포를 모두 포함합니다. 
환자 특이적인 체외 종양 모델은 발암 메커니즘을 밝히고 맞춤형 치료를 위한 약물 선택을 맞춤화할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 IDH1 돌연변이 저등급 신경교종에 특화된 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델이 없기 때문에 기초 및 중개 연구에 차질이 빚어지고 있습니다. 여기에서는 효소 해리 없이 IDH1 돌연변이 종양을 정의된 배지에서 외식식물로 배양하는 간단한 방법을 제시합니다. 이러한 외식은 IDH1 돌연변이 단백질 발현뿐만 아니라 ASCL1(MASH1), OLIG1 및 OLIG2와 같은 희소돌기아교세포 전구 세포 및 성상세포(GFAP, SOX9)에 대한 마커를 유지하면서 장기간 지속될 수 있습니다. 또한 DMSO의 동결된 종양에서도 확립할 수 있습니다. 이러한 배양은 약물 스크리닝, 비디오 현미경 검사 및 유전자 연구를 위한 귀중한 플랫폼 역할을 할 수 있으므로 이러한 까다로운 종양을 이해하고 치료하는 데 있어 발전을 촉진할 수 있습니다. 또한 IDH1 돌연변이 세포주를 유도할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

며칠 후, 일부 종양 조각이 웰 표면에 부착되어 엑스플란트로부터 세포 성장이 시작됩니다. 초기 분주 후 종양 성장 세포가 나타날 때까지 걸리는 시간은 샘플마다 다릅니다. 초기 배양물에는 흔히 상당한 양의 세포 파편이 포함되어 있어 생존 세포의 존재 여부를 평가하기 어렵습니다. 따라서 배양은 최소 4주 동안 유지해야 합니다. 세포가 성장하기 시작하면, 양극성 또는 다극성 외형을 가진 길쭉한 세포들이 관찰됩니다(그림 2B,C).
냉동 보존된 분쇄 종양을 해동할 때, 엑스플란트 배양(explant culture)의 성공률이 약간 감소할 수 있습니다. 냉동 보존의 영향을 정확하게 정량화하지는 않았으나, 성공률의 감소는 미미한 것으로 보입니다. 다음 세 가지 사례에서 확인할 수 있듯이, 신선한 종양 유래 세포와 냉동 보존된 종양 유래 세포 간의 세포 형태에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. <stro...

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종은 배양이 어려운 희귀 종양입니다. IDH1 돌연변이 단백질 발현을 보존하고 수개월 동안 배양을 유지하는 간단한 비효소 외식 방법을 소개합니다. 중요한 것은 이 기술이 동결 보존된 종양에 작용하여 신경교종 연구에 귀중한 자원을 제공한다는 것입니다.

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 미만성 내인성 폰틴 신경교종 또는 DIPG에 영향을 받은 뇌간 조직에서 신경교전구세포를 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 효소 소화를 통해 종양 조직에서 분리된 신경교세포는 신경기저 배지에서 배양되어 성장과 자유롭게 떠다니는 신경구의 발달을 촉진합니다.

확산성 내인성 폰틴 신경교종(Diffuse Intrinsic Pontine Glioma)으로부터 세포 분리 및 배양(Isolating and Culturing Cells from Diffuse Intrinsic Pontine Glioma)

악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다.

1차 성우 성안 성액 제노이식은 침투 성장을 재구성하고 탈수소 효소 I 돌연변이를 이소염시분해합니다.

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다.

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

이 연구는 1) 인간 에서독점적으로 인간 신경 유기 체 내 인간 교모세포종 개발 및 2) 뉴런 도파민성 연구를 위한 관련 및 정확한 모델로 두 개의 특정 인간 신경 오르가노이드를 도출하는 프로토콜을 소개하고 기술합니다. 3차원 오르가노이드를 생성하는 분화.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

단백질체 조절 장애는 확산 침윤성 신경교종의 확산에 중요한 역할을 하지만 몇 가지 관련 단백질은 아직 확인되지 않았습니다. 디지털 공간 처리(DSP)는 침윤성 신경교종의 침습 및 이동에 기여할 수 있는 후보 단백질의 차등 발현을 특성화하기 위한 효율적인 고처리량 접근 방식을 제공합니다.

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

여기에서는 1차 환자 검체 또는 환자 유래 세포 배양에서 교모세포종(GBM) 오가노이드를 생성하고 성숙할 때까지 유지하는 방법을 설명합니다. 이러한 GBM 오가노이드는 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하고 생체 외 종양 미세 환경을 재현합니다.

3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

배우세요 IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 비효소적 외식 배양법을 통해 장기간 세포를 유지하는 방법을. 이 기술은 종양 세포 가소성 연구와 신경종양학 발전에 필수적인 자원을 제공합니다.

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜

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