Name: Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 탐색하세요 광유전학적 알로스테릭 스위치 LightR를 이용한 Src 키나아제 활성의 시공간 제어 방법을. HeLa 세포에서 가역적인 광 조절을 통해 세포 이동 및 신호 전달 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>광 조절 Allosteric Switch를 사용한 효소 활성의 광유전학적 제어

<table><tbody><tr><td>#1.5 유리 커버슬립 25mm 라운드</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브&nbsp;</td><td>미국 과학&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 버퍼</td><td></td><td></td><td>500 mL용: 5.18 g of&nbsp; Tris-HCL, 131.5 mL의 글리세롤, 52.5 mL의 20% SDS, 0.5 g의 브로모페놀 블루, 최종 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED 현미경 링 라이트</td><td>볼리 광학</td><td>ML46241324</td><td>블루 LED, 60mm 직경, 5W</td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 항체</td><td>세포 신호</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH 항체</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry 항체</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>세포 신호</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxillin</td><td>세포 신호 전달</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 항체</td><td>세포 신호</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-pY249 p130Cas</td><td>세포 신호</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Y118 Paxillin</td><td>세포 신호</td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Anto-phospho-S217/221 MEK</td><td>세포 시그널링</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>아두이노 호환 전원 공급 장치</td><td>기업 컴퓨터</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>아두이노 우노 Rev3</td><td>아두이노</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>벤치마크 소 태아 혈청(FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>열 비활성화 트리플 0.1 &micro; M 멸균 필터&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>선물, Dr. John O'Bryan, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>골드바이오텍</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Disodium)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Deep Red 플라스마 막 염료</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a 유능 세포&nbsp;</td><td>네브&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNA 사다리&nbsp;</td><td>골드바이오&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>DNTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1 효소&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Cleland의 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>아크로스&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>소 혈장에서 추출한 Fibronectin&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 형질주입 시약&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>젤 그린 핵산 염색&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 염료 퍼플 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 젤 추출 키트&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>K0692</td><td>젤 추출 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJET 플라스미드 미니프렙 키트</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>HEK 293T 셀&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>피셔&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>IoT 릴레이</td><td>디지털 로거</td><td>DLI 705020645490</td><td>AC/DC 제어 릴레이 조명용</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>코닝&nbsp;</td><td>10-045-이력서&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED 그로우 라이트 시스템</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>LED 패널 램프 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>CellGEO 스크립트 실행을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>이미징 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>피셔 케미컬</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마&nbsp;</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep 키트&nbsp;</td><td>유전자 선택&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤 12 웰</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>46-000-이력서&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멀티밴드 폴리크로익 미러</td><td>89903BS</td><td>크로마</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>피셔 케미컬</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca 및 Mg&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Dr. Channing Der's Lab, UNC PCR Tubes에서 선물</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8-스트립 튜브 및 캡, 강성 스트립 개별적으로 부착된 돔 캡&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>폴리곤 400 패턴 조명기</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>프라이머&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/필터 페이퍼 샌드위치&nbsp;</td></tr><tr><td>T0.25% 트립신, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] 코닝나트륨</td><td>&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>트리스-아세테이트-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>피셔&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>전기영동용&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x 현미경 대물</td>렌즈 <td>올림푸스</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL 박스</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>TTL 인터페이스</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>피셔 화학&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic allosteric regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

LightR-Src는 그림 1A,B에 설명된 전략에 따라 설계 및 생성되었습니다. LightR-Src의 생화학적 분석은 60분의 연속 조명에서 청색광에 반응하여 알려진 내인성 Src 기질, p130Cas(Y249)22 및 paxillin(Y118)23의 인산화에 액세스합니다(그림 2B). 특히, LightR-Src가 형질주입 후 16-18시간 동안 어둠 속에서만 발현되는 경우 Src 키나아제의 배경 활성화가 관찰되지 않습니다. 또한, D388R 돌연변이가 있는 LightR-Src의 촉매 비활성 돌연변이는 Src 기질의 인산화를 유도하지 않으며, 이는 인산화가 활성 LightR-Src에 의해 수행되며 청색광 조명의 비특이적 효과에 의해 발생하지 않음을 보여줍니다(그림 2B). 살아있는 세포에서 Src27 키나아제의 진동 활성에 대한 보고를 인정하여 LightR-Src가 주기적 활성화를 나타내도록 조정할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 원래의 LightR-Src는 느린 비활성화 동역학을 보였으며(그림 2C), 두 VVD에서 I85V 돌연변이를 품고 있는 새로운 변이체인 Fast-LightR-Src의 생성을 촉발했습니다. 그림 2D는 Fast-LightR-Src가 LightR-Src의 경우 1시간 이상에 비해 조명을 끈 후 10분 이내에 현저히 빠른 비활성화 역학을 보여주고 완전히 비활성화됨을 보여줍니다. FastLightR-Src를 사용하여 활성화/비활성화의 반복적인 주기도 달성할 수 있었습니다(그림 2E). 이러한 결과는 살아있는 세포에서 Src 활성을 구체적이고 엄격하게 제어하는 조절을 달성하는 LightR 도구의 능력을 총체적으로 보여줍니다.
FastLightR-Src의 응용 프로그램은 또한 세포 형태 역학에 대한 일시적인 Src 활성화의 효과를 평가할 수 있습니다. HeLa 세포에서 FastLightR-Src의 활성화는 세포 확산을 유도하며, 이 과정은 FastLightR-Src가 비활성화되는 즉시 중단됩니다. 활성화 시, 우리는 FastLightR-Src가 핵주위 구획에서 초점 접착 및 원형질막으로 전위되는 것을 관찰했으며, 이는 야생형 Src 키나아제11,12에 의해 나타나는 거동입니다. 촉매적으로 비활성 돌연변이 D388RLightR-Src를 발현하는 조명 세포는 이러한 확산 효과를 나타내지 않습니다(그림 3B, C). 이는 FastLightR-Src가 와일드 타입과 유사하게 기능한다는 것을 추가로 확인합니다. 세포 영역의 국소 조명은 국소 접착에서 국소 축적 LightR Src로 표시되는 FastLightR-Src의 국부적 활성화를 초래하고 국소 막 돌출부(그림 4B (i), (ii)) 및 세포 중심 이동(그림 4C (i), (ii))의 형성을 동반하여 세포가 빛을 향해 이동하도록 합니다. Src kinase 조절을 위한 LightR 도구의 응용 프로그램을 확립한 후, bRaf kinase 및 DNA recombinase Cre의 조절로 확장된 LightR의 광범위한 유용성을 소개합니다. LightR-bRaf의 분석은 bRaf, MEK1의 내인성 기질의 광 유도 인산화와 ERK1/2 키나아제24,25의 다운스트림 인산화를 구성적 활성 bRaf 돌연변이(V600E)와 유사한 수준으로 보여줍니다(그림 5A). 반대로, 촉매적으로 비활성인 D575RLightR-bRaf는 비조명 LightR-bRaf 샘플에 필적하는 MEK1 및 ERK1/2 인산화를 보여주지 않으므로 LightR-bRaf 조절의 특이성을 확인할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징은 FastLightR-bRaf 활성화/불활성화의 반복적인 주기가 ERK2의 핵 안팎으로의 반복적인 전위를 유도한다는 것을 보여주었으며, 이는 bRaf 활성화28의 알려진 결과와 일치합니다(그림 5B). LightR-Cre의 활성화는 리포터 mCherry 유전자의 성공적인 재조합을 초래하며, 이는 LightR이 다양한 종류의 효소에 적용될 수 있음을 보여줍니다(그림 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
그림 1: LightR 접근 방식의 개발 전략. (A) 어두운 상태(PDB: 2PD7)의 두 Vivid 단량체와 켜진 상태(PDB: 3RH8)의 이량체의 결정 구조. (B) LightR 디자인의 만화 표현. 촉매 영역에 삽입된 두 개의 탠덤으로 연결된 VVD 광수용체는 어둠 속에서 단백질의 촉매 활성을 방해합니다. 청색광에 반응하는 VVD의 이합체화는 단백질 활성을 복원합니다. (C) (i) Src(PDB 1Y57) 및 (ii) bRaf(PDB 4MNF) 촉매 도메인의 결정 구조. (ii) Cre 재조합 효소 (PDB 1MA7)의 구조. 노란색 화살표는 LightR 삽입 부위를 나타내고 치환된 아미노산을 나타냅니다. (D) 표적 효소 서열19에 LightR 도메인 삽입을 위한 클로닝 전략의 개략도. 1단계에서는 삽입 부위 전후에 표적 유전자에서 어닐링하는 부위가 측면에 있는 LightR 단편의 PCR 합성에 특별히 설계된 프라이머를 사용합니다. 단계 2에서, 이렇게 생성된 LightR 단편은 퀵 체인지 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 타겟 효소 유전자에 LightR을 삽입하기 위한 "메가프라이머"로 사용되는 것으로 나타났습니다. 패널 A-C는 Shaaya et al.10의 허가를 받아 조정 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
그림 2: 엔지니어링된 LightR-단백질의 생화학적 특성 분석. (A) LightR Src의 생화학적 특성화를 위한 실험 프로토콜의 개략도. (B) C-말단에서 mCherry 및 myc 태그를 가진 LightR Src 구조를 일시적으로 발현하는 LinXE 셀은 465nm LED 설정을 사용하여 60분 동안 청색광으로 지속적으로 조명되었습니다. 세포 용해물을 Src 기질, 팍실린 및 p130Cas의 인산화를 조사했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 살아있는 세포에서 LightR-Src의 활성화에 반응하여 내인성 팍실린과 p130Cas의 인산화를 보여줍니다. (씨,디) C-말단에서 탠덤 mCherry-myc 태그를 지닌 표시된 LightR-Src 구조체를 일시적으로 발현하는 LinXE 세포는 지정된 시간(0분 및 30분) 동안 청색광에 지속적으로 노출된 다음 표시된 시간 동안 어둠 속에 배치되었습니다. 세포 용해물을 Src 기질의 인산화를 조사하여 (C) LightR-Src 및 (D) FastLightR-Src 간의 활성화 및 비활성화 역학을 비교했습니다. (E) C-말단에서 탠덤 mCherry-myc 태그를 지닌 지시된 LightR-Src 구조를 일시적으로 발현하는 LinXE 세포는 20분 동안 청색광에 지속적으로 노출된 후 10분 동안 어두운 곳에서, 20분 동안 빛 속에서 반복적으로 배양되었습니다. 세포 용해물을 수집하고 Src 기질의 인산화를 조사하여 활성화와 불활성화 상태 사이의 Src 키나아제 순환의 효율성을 보여주었습니다. 모든 실험을 최소 3회 반복하여 유사한 결과를 얻었다. 각 웨스턴 블롯 패널 B-E 옆에 표시된 숫자는 킬로달톤(kDa)으로 측정된 단백질의 분자량을 나타냅니다. 패널 B-E는 Shaaya et al.10의 허가를 받아 수정 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
그림 3: 전역 및 시간 조명 제어 및 FastLightR-Src 활동에 미치는 영향. (A) 전역 및 시간 순환 조명의 실험 계획과 후속 데이터 분석의 만화 표현. (나,씨) 청색광에 의한 세포 형태 조절 및 FastLightR-Src 국소화는 광시야 형광 현미경을 사용하여 time-lapse 시리즈에서 얻은 HeLa 세포의 대표 이미지에 묘사되어 있습니다. 이 세포는 Stargazin-iRFP670(원형질막 마커)과 함께 FastLightR-Src-mCherry-myc(N = 10개 세포) 또는 촉매 비활성 D388RLightR-Src-mCherry-myc(N = 9개 세포)를 일시적으로 동시 발현했습니다. 살아있는 세포 이미징은 세포가 청색광(파란색 윤곽선)으로 전체적으로 조명되는 동안 매분 수행되었습니다. (B) 노란색 화살표는 초점 접착과 유사한 구조에서 FastLightR-Src 국소화를 강조합니다. 이미지는 광시야 형광 현미경을 사용하여 일련의 HeLa 세포에서 얻었습니다. (C) FastLightR-Src 대 D388RLightR-Src의 활성화에 의해 유도된 세포 면적의 변화를 정량화한 것이 각 패널에 표시됩니다. 조명 창은 파란색 사각형으로 표시됩니다. 그래프는 평균 ± 90% 신뢰 구간을 나타냅니다. 패널 B와 C는 Shaaya et al.10의 허가를 받아 수정 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
그림 4: 국소 세포하 조명 제어 및 FastLightR-Src 활성에 미치는 영향. (A) 국소 Subcellular 조명 제어의 실험 계획의 만화 표현. (B) (i) 청색광(파란색 원으로 표시)으로 국부적으로 조명된 FastLightR-Src-mCherry를 발현하는 HeLa 세포를 보여주는 타임랩스 시퀀스. 이미지는 전반사 형광 현미경(60x 대물렌즈)을 사용하여 매분 캡처되었습니다. 이미지는 지정된 시간 간격으로 얻은 반전된 대비 이미지로 표시됩니다. (ii) 지정된 시간 간격 동안 형성된 돌출부를 표시하는 셀 투영 이미지. 실험 타임라인에 걸쳐 세포 형태를 임계값 설정하고 마스킹하는 것은 세포 확산 및 세포 가장자리 역학을 분석하기 위한 플랫폼을 나타냅니다. 셀의 지정된 조명 영역은 파란색 원으로 윤곽선이 표시됩니다. (C) (i) 국부 청색광 조명에 대한 중심의 이동 거리(d) 및 편차 각도(θ)를 나타내는 셀의 극좌표 플롯. 검은색 점은 촉매적으로 비활성 D388RLightR-Src(N = 6개 세포) 또는 FastLightR-Src(N = 10개 세포)를 발현하는 개별 HeLa 세포를 나타냅니다. (ii) 국부 청색광 자극의 시작 (1)에서 결론 (2)까지 세포의 중심이 이동한 중심 이동 거리(d)를 보여주는 개략적인 표현. 편차각(θ)은 청색광의 위치에서 세포의 중심 이동 발산 정도를 나타냅니다. 연한 회색 음영은 국소 FastLightR-Src 자극에 대한 반응으로 세포에 의해 돌출된 영역을 나타냅니다. 셀의 지정된 조명 영역은 파란색 단색 원으로 표시됩니다. 패널 B와 C는 Shaaya et al.10에서 수정 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
그림 5: LightR 접근 방식의 광범위한 적용 가능성. (a) LightR-bRaf의 규제. LightR-bRaf-Venus, 촉매 비활성 D575R LightR-bRaf Venus 또는 구성적으로 활성화된 bRaf(V600E)-Venus를 일시적으로 발현하는 LinXE 세포는 지정된 기간 동안 연속적인 청색광에 노출되었습니다. 세포 용해물은 지시된 단백질의 인산화를 위해 조사되었습니다. (B) 광시야 형광 현미경을 사용한 일련의 라이브 셀 이미징의 타임랩스 시리즈에서 얻은 대표 이미지는 FastLightR-bRaf-Venus 및 mCherry-ERK2를 일시적으로 동시 발현하는 LinXE 세포에서 글로벌 청색광 반응의 조절을 보여줍니다. 이 셀들은 파란색으로 표시된 지정된 기간 동안 청색광(초당 50ms 펄스, 분당 50펄스)으로 전 세계적으로 조명되었습니다. mCherry-ERK2의 라이브 셀 이미징은 1분마다 수행되었습니다. 노란색 화살표는 엔지니어링된 bRaf의 청색광 활성화에 의해 유도된 핵 ERK2 국소화 단계를 표시합니다. (C) LinXE 세포는 Floxed-stop-mCherry 리포터 및 LightR-Cre-iRFP670과 일시적으로 동시 transfection되었습니다. 세포는 최대 8시간 동안 어두운 조건 또는 깜박이는 청색광(2초 켜짐, 10초 꺼짐)에 노출되었습니다. 광시야 형광 현미경(10x objective)을 사용하여 동일한 설정에서 각 채널의 모든 시점에 대한 이미지를 획득하고 샘플 간 단백질 발현 수준을 쉽게 비교할 수 있도록 일관된 밝기 및 대비 수준으로 조정되었습니다. 실험을 최소 세 번 반복하여 유사한 결과를 얻었습니다. 이 그림은 Shaaya et al.10에서 수정 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: LightR 시퀀스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: LightR 삽입 부위에 대한 설명 및 LightR-단백질 설계를 위한 체크리스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3: LightR 클로닝을 위한 프라이머. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 4: LightR-Protein 활성의 생화학적 분석을 위한 transfection 조건. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 5: LightR-Protein 활성의 이미징 기반 분석을 위한 Transfection 조건. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: IDE(Integrated Development Environment)를 사용한 펄스 조명. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 현미경 조명 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

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이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

이 프로토콜은 PhyB 및 PIF3를 사용하여 적색광 및 원적외선으로 유전자 발현을 제어하기 위한 광유전학적 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 간단하고 유연한 조명 시스템을 구축하기 위한 단계별 지침이 포함되어 있어 컴퓨터로 유전자 발현 또는 기타 광유전학을 제어할 수 있습니다.

광유전학 실험을 위한 간단하고 다양한 조명 시스템 구축

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 자동화된 플랫폼 Lustro를 활용하여 효모의 광유전학 시스템의 고처리량 특성 분석을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

자동화된 플랫폼 Lustro를 사용한 효모의 고처리량 광유전학 실험

이 동영상은 절개와 태아 thymus의 제거뿐만 아니라 2 dGuo - 처리 thymus의 전 생체내 문화의 준비를 보여줍니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

탐색하세요 광유전학적 알로스테릭 스위치 LightR를 이용한 Src 키나아제 활성의 시공간 제어 방법을. HeLa 세포에서 가역적인 광 조절을 통해 세포 이동 및 신호 전달 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

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