Name: Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 학습하세요 생체 내 현미경을 이용하여 장간막 허혈-재관류 손상 후 정맥 내 호중구 세포 외 트랩을 시각화하는 방법을 배우세요. 내피 PAR1 발현과 장내 공생균이 염증 반응에 미치는 영향을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>I/R 손상 중 백혈구 접착 및 NET 형성에서 내피 PAR1의 역할

<table><tbody><tr><td>아크리딘 오렌지</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>&nbsp; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 곱하기 PCR-플래튼&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>설치류용 마취 시스템</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>black dough</td><td>Staedtler</td><td></td><td>모델링 클레이</td></tr><tr><td>CD146 Microbeads, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>올림푸스</td>, <td>올림푸스, cellSense, Dimension, Desktop 2.3</td><td>소프트웨어</td></tr>, <tr><td>전하 결합 장치, 카메라</td>, <td>Hamamatsu, Photonics,</td><td>ORCA-R2</td>, <td>카메라</td></tr>, <tr><td>면봉</td>, <td>B&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 헤모스탯 125mm/5"</td><td>인디고 악기&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>Balea</td><td>적용</td><td></td>불가</tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Extra Narrow Scissors &ndash; Straight/Sharp-Sharp/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치 "Dumont #5" (Inox, 팁 0.1mm, 길이 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>isoflurane&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Leukofix 의료용 테이프</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>간 해리 키트, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS-Separation columns MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 스마트 스트레이너 100 &마이크로; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>비흡수성 꼰 실크 봉합사, 크기: 7/0, 91 미터&nbsp;</td><td>정밀 과학 도구</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51WI 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>PCR 튜브 스트립</td><td>용 Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 뚜껑</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Plyethylene 카테터</td><td>스미스 의료 Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>프롤렌 (8648G), 폴리 프로필렌 6-0, 나트재료&nbsp;</td><td>존슨 & 존슨 메디컬 GmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>역탄스크립션 키트 (고용량 cDNA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>학교 규모&nbsp;</td><td>컨 & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위 - 각도가 있는</td><td>측면 FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>직선 지혈 135mm/5.5"</td><td>인디고 악기&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 오렌지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러 TC-1000</td><td>FMI F&ouml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>해당 사항</td><td></td>없음</tr><tr><td>조직집게 - 1x2 치아</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>혈관 클램프</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after mesenteric ischemia-reperfusion injury via intravital microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after mesenteric ischemia-reperfusion injury)

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

백혈구 롤링 및 접착 및 NET 형성에 대한 내피 세포 의존적 효과를 연구하기 위해 처음에는 내피 세포에서 VE-Cadherin Cre 유도 F2r 결핍의 효능을 조사했습니다. 간 내피 세포를 분리하기 위해 자기 세포 분류가 사용되었습니다. 그 후, RNA를 분리한 후 정량적 real-time PCR(qRT-PCR)을 수행했습니다. VE-Cadherin promoter의 제어하에 발현된 Cre 재조합효소가 없는 F2rΔEC 마우스는 WT 대조군에 비해 F2r (PAR1) mRNA 수치가 현저히 감소(약 1/3)된 것으로 나타났습니다(그림 1).
마우스 라인의 결핍을 확인한 후, 장간막 I/R 손상을 수행하여 혈관 내피 세포가 발현하는 PAR1이 생체 내 현미경으로 시각화된 백혈구 롤링 및 접착에 미치는 영향을 조사했습니다(그림 2A, B). 허혈 1시간 후, 클램프를 제거하고 혈관을 재관류시켰습니다. 백혈구 굴림과 유착이 관찰되고 기록되었습니다(녹색으로 염색되고 흰색 화살표로 표시). 두 그룹 모두 I/R 손상 후 부착 백혈구 수가 증가한 것으로 나타났지만, 내피 F2r (PAR1)의 결핍으로 인해 I/R 활성화 장간막 내피에 대한 백혈구 접착력이 현저히 감소하지는 않았으며, 이는 허혈성 장간막 정맥에 대한 백혈구 동원에서 내피 PAR1 활성화의 적극적인 역할을 시사합니다(그림 2C).
다음 목표는 내피 PAR1 발현이 I/R 손상으로 인한 NET 형성을 조절하는지 여부를 조사하는 것이었습니다. 그러므로, 세포외 핵산을 세포 불투과성 염료(30)로 염색하고, 생체 내 현미경(검은색 화살표로 표시)을 사용하여 생성된 NET을 시각화하였다(그림 2A,B). I/R 손상 후, NET은 내피 세포에서 정상 수준의 PAR1을 발현하는 WT 그룹에서만 관찰되었으며, 이는 NETosis에서 PAR1의 조절 역할을 나타냅니다(그림 2C, D). 특히, 내피 F2r 발현이 억제되었을 때, I/R로 손상된 장간막 정맥에는 NET이 존재하지 않았다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
그림 1: F2r(PAR1) mRNA 발현. L32 하우스키핑 유전자에 상대적인 WT(n = 6) 및 F2rΔEC(n = 9) 마우스의 F2r 간 내피 세포 발현. 데이터는 95% 신뢰 구간의 중위수로 표시됩니다. Mann-Whitney 검정은 두 개의 독립 그룹 *p &lt; 0.05를 비교하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
그림 2: 내피 PAR1은 I/R 손상 장간막 정맥에서 백혈구 접착 및 NET 형성에 영향을 미칩니다. I/R 부상 전(사전) 및 후(사후) (A) 10배 및 (B) 20배 배율의 WT 및 F2rΔEC 마우스의 Acridine 주황색(흰색 화살표)으로 염색된 부착 백혈구 및 Sytox 주황색(검은색 화살표)으로 염색된 NET의 대표적인 생체 내 현미경 이미지. 눈금 막대 : A, 50 μm; B, 20 μm. (C) 백혈구 접착 및 (D) WT (n = 7) 및 F2rΔEC (n = 4) 마우스의 mm2 당 NETs (전) 및 후 I / R 부상 후. 모든 데이터는 95% 신뢰 구간에서 중앙값으로 표시되었습니다. Two-way ANOVA test, **p&lt; 0.01 및 Sídák의 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 비교를 수행하여 모든 시점(허혈 전후 및 후)에서 서로 다른 유전자형의 평균을 비교했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

학습하세요 생체 내 현미경을 이용하여 장간막 허혈-재관류 손상 후 정맥 내 호중구 세포 외 트랩을 시각화하는 방법을 배우세요. 내피 PAR1 발현과 장내 공생균이 염증 반응에 미치는 영향을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury) (동영상) | JoVE Journal

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