Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

혈전증의 발병과 발병에 대한 특정 유전자의 역할, 이 경우 허혈-재관류 손상에 대한 내피 PAR1 발현을 조사합니다. 우리는 허혈 후와 재관류 중 반응에 대한 내피의 영향을 정확히 찾아내려고 합니다. 지금까지 충분히 연구되지 않은 정말 중요한 측면은 장간막 허혈-재관류 손상에서 장 공생체의 역할을 정확히 찾아내는 것입니다.

이 질문을 연구하기 위해 우리 그룹은 생체 내 현미경 검사와 장간막 허혈-재관류 손상 모델을 결합했고, 이를 무균 마우스 모델과 결합했습니다. 형질전환 마우스에 혈전증 모델을 적용하고 생체 내 현미경 검사와 함께 이러한 기술을 통해 질병 발병 시 세포 행동의 생체 내 관찰을 가능하게 합니다. 살아있는 유기체에 대한 실험 모델을 수행하는 것은 실험이 성별, 연령, 마취 치료, 동물 복지 규정 변경 등을 포함한 많은 요인의 영향을 받기 때문에 항상 어려운 일입니다.

또한 혈전증에 대한 연구는 지난 세기에 시작되었습니다. 많은 기여 요인이 여전히 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리 그룹은 혈전증, 죽상동맥경화증, 혈소판 기능 및 혈관화에 대한 장내 미생물총(microbiota)의 역할을 연구합니다.

시작하려면 마취되고 면도한 마우스를 가열 패드의 등쪽 누운 자세로 놓습니다. 노즈콘을 통해 마우스를 산소 시스템에 연결합니다. 수술 테이프로 가열된 패드에 마우스의 팔다리를 고정합니다.

경정맥에 카테터를 이식하려면 기관을 가로 절개합니다. 목을 덮고 있는 피부를 제거하고 오른쪽 경정맥을 분리합니다. 그런 다음 5cm 길이의 명주실을 사용하여 정맥의 말단 끝을 닫고 수술 겸자로 고정합니다.

정맥 아래 약 2cm, 하나는 원위 끝 근처에, 두 개는 경정맥의 근위부 끝 근처에 3개의 명주실을 놓습니다. 수술 매듭을 묶되 혈관을 닫지 마십시오. 폴리에틸렌 카테터에 0.9%염화나트륨을 채웁니다.

기포를 제거하고 1ml 주사기에 꽂습니다. 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 매듭 사이에 구멍을 뚫고 카테터를 경정맥에 이식합니다. 주사기를 흡인하여 카테터에 혈액이 있는지 확인합니다.

카테터를 정맥에 고정하기 위해 실크 실을 묶습니다. 그런 다음 의료용 테이프를 사용하여 주사기를 고정합니다. 1밀리리터 주사기에 0.5밀리리터당 0.5밀리그램의 아크리딘 오렌지를 채우고 5마이크로몰 농도의 핵산 염료를 채웁니다.

호중구 세포외 트랩(NET)을 위해 50마이크로리터의 SYTOX Orange를 주입합니다. 요오드 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 마우스의 복부 피부를 소독합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 선형 알바를 따라 3-5cm 개복술을 수행합니다.

식염수에 적신 두 개의 면 팁을 사용하여 장을 복강 밖으로 부드럽게 배치하고 지방이 최소한으로 덮인 위치를 식별합니다. 검은 반죽 위에 장의 작은 가지를 올려 배경 신호를 줄입니다. 경정맥 카테터를 통해 50마이크로리터의 아크리딘 오렌지를 주입하여 염색된 백혈구를 시각화합니다.

허혈 재관류 전 장의 비디오를 획득합니다. 염화나트륨을 적신 찜질을 준비하고 그 안에 장을 넣으십시오. 작은 혈관 클램프로 상장간막 동맥을 폐색합니다.

식염수에 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 7-0 봉합사를 사용하여 복벽을 닫고 수분과 온도의 손실을 방지합니다. 1시간 후 봉합사를 제거합니다.

허혈 기간이 지나면 잘린 부위에 식염수 몇 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 클립 애플라이어를 사용하여 미세혈관 클립을 부드럽게 제거합니다. 식염수에 적신 면 팁을 사용하여 장을 복강 밖으로 부드럽게 다시 놓고 정맥의 작은 가지를 검은 반죽 위에 놓습니다.

50마이크로리터의 아크리딘 오렌지를 주입하고 정맥의 허혈 후 비디오를 캡처합니다. 장거리 콘덴서, 모노크로메이터, 10배 침수 대물렌즈 및 전하 결합 장치 카메라가 장착된 고속 광시야 형광 현미경을 켭니다. 노출 시간을 30밀리초로 설정하고 Alexa Fluor 488 및 Rhodamine Red 필터가 설치된 5B 채널을 선택하여 백혈구와 NET을 시각화합니다.

0.06제곱밀리미터 관심 영역 내에서 세포 동원을 정량화합니다. 그런 다음 20초의 관찰 기간 동안 내피 내막에 고정되어 있거나 부착된 세포를 계수하여 부착 백혈구를 정량화합니다. 백혈구 및 핵산 형광 염료로 표지된 NET을 식별합니다.

허혈성 장간막 내피에 대한 백혈구 부착은 허혈-재관류 손상 후 야생형 및 F2r 델타 EC 그룹 모두에서 증가했으며, F2r 델타 EC 그룹에서 관찰된 접착력이 현저히 낮았으며, 이는 백혈구 모집에서 내피 PAR1의 역할을 암시합니다. 허혈-재관류 손상 후, NET은 내피 세포에서 정상 수준의 PAR1을 발현하는 야생형 그룹에서만 관찰되었으며, 이는 NETosis에서 PAR1의 조절 역할을 나타냅니다.