August 1st, 2025
여기에서는 R을 사용하여 마우스 피부 상처 치유의 단일 세포 시간 경과 전사체학 데이터 세트를 분석하기 위한 단계별 시각적 워크플로를 제시합니다. 이 프로토콜에는 Seurat를 사용한 데이터 세트 다운로드, 품질 관리, 시각화 및 세포 유형 주석과 CellChat을 사용한 세포-세포 상호 작용 분석을 위한 표준 파이프라인이 포함되어 있습니다.
우리 연구실에서는 시스템 생물학 및 생물정보학 접근 방식과 함께 단일 세포 및 공간 전사체학과 같은 새로운 도구를 사용하여 차등 치유 결과의 시공간 세포 역학을 조사합니다. 최근 몇 년 동안 우리는 인간과 생쥐와 같은 모델 유기체의 상처 치유 연구에 단일 세포 전사체학이 빠르게 채택되는 것을 보았습니다. 단일 세포 데이터 세트의 전체 분석은 생물정보학 경험이 거의 또는 전혀 없는 벤치 과학자에게는 금지되어 있습니다. 이는 상처 치유 분야의 과학자들이 단일 세포 데이터 세트를 충분히 활용하지 못하는 경우가 너무 많다는 것을 의미합니다. 이것은 생물정보학에 대한 사전 경험이 없다고 가정하는 최초의 포괄적인 프로토콜로, 상처 치유 연구의 맥락에서 데이터 세트 다운로드부터 관련 분석 출력까지 사용자를 안내합니다. 우리의 프로토콜은 상처 치유 연구자가 자신의 단일 세포 데이터 세트를 보다 완벽하게 분석하고 공개적으로 사용 가능한 데이터 세트에서 새로운 통찰력을 추출할 수 있는 템플릿 역할을 해야 합니다.
[샬린] 시작하려면 수탁 번호 GSE204777를 사용하여 유전자 발현 옴니버스 저장소에서 데이터 세트 파일로 이동합니다. GSM6190913라는 제목의 첫 번째 데이터 세트를 클릭합니다. GSM6190913 페이지 하단으로 스크롤하여 FTP 또는 HTML 링크를 사용하여 나열된 세 개의 파일을 다운로드합니다. 컴퓨터의 파일 탐색기를 사용하여 다운로드한 파일을 b1이라는 디렉토리로 이동하여 작업 디렉토리 내에 있는지 확인합니다. 다운로드된 단일 셀 시퀀싱 파일에 대한 디렉토리 경로 정보를 검색하십시오. 이제 단일 셀 시퀀싱 파일을 작업 환경에 로드합니다. 그런 다음 유전자 발현 및 다중화 HTO 데이터를 작업 데이터 세트에서 분리합니다. 유전자 발현 데이터를 사용하여 Seurat 객체를 생성하면서 5개 미만의 세포와 200개 미만의 유전자를 가진 세포에서 검출된 유전자를 필터링합니다. HTO 데이터가 없는 데이터 세트의 경우 동일한 필터링 매개변수로 Seurat 객체를 생성하고 유전자 발현 분석으로 전환합니다. 각 세포의 미토콘드리아 유전자 백분율을 계산하고 이 값을 메타데이터 변수로 할당합니다. 모든 세포에서 유전자 수, 총 RNA 및 미토콘드리아 유전자 비율의 분포를 시각화합니다. 임계값을 사용하여 미토콘드리아 함량이 25%를 초과하는 세포를 제거하고 이러한 저품질 세포를 필터링한 후 업데이트된 분포를 시각화합니다. SC 이중항 파인더 방법을 사용하여 가능한 이중항을 감지합니다. 명령을 사용하여 SC 이중선 파인더 파이프라인을 실행하고 결과 이중선 점수를 새 메타데이터 변수로 할당합니다. 이제 모든 셀에 걸쳐 이중항 점수의 분포를 시각화합니다. 이중항 점수가 0.25 이상인 모든 셀을 제거하고 정리된 Seurat 객체를 작업 디렉토리에 RDS 파일로 저장합니다. 데이터 정규화, 스케일링 및 기본 구성 요소 분석을 수행합니다. 처음 50개 기본 구성 요소에 대한 분산 기여도를 시각화합니다. 처음 13개의 주요 구성 요소와 0.1의 클러스터링 해상도를 사용하여 셀을 클러스터링합니다. 처음 13개의 기본 성분을 사용하여 균일한 다양체 근사 및 투영 또는 인접 분석에서 UMAP 축소를 수행하고 시드 번호를 123으로 설정합니다. 이제 UMAP 플롯에서 세포 클러스터링을 시각화한 다음 UMAP 플롯에서 상처 시간 및 공간 주석을 시각화합니다. 그런 다음 셀 클러스터를 상처 시간 및 공간 주석과 연결하는 테이블을 생성합니다. 모든 클러스터 간에 차등적으로 발현된 유전자를 계산한 후 주요 세포 유형 ID를 결정하고 결과 DEG 목록을 변수에 할당한 후 작업 디렉토리에 구분된 텍스트 파일로 저장합니다. 이제 스프레드시트 애플리케이션에서 데이터 세트 클러스터 마커 파일을 엽니다. 텍스트 가져오기 마법사를 사용하여 쉼표를 구분 기호로 설정하고 유전자 이름 열을 텍스트로 서식을 지정하여 유전자 이름이 날짜로 자동 변환되지 않도록 합니다. 스프레드시트에서 평균 로그 2 FC 열의 순위를 가장 큰 것부터 가장 작은 것까지 정렬하여 로그 2배 변경 값을 줄인 다음 클러스터 열을 가장 작은 것에서 가장 큰 것으로 줄여 행을 정렬합니다. Seurat 클러스터 번호를 늘려 행을 정렬하려면 평균 로그 2 FC 열을 필터링하여 2.5보다 크거나 같은 값만 포함한 다음 PCT 1 열을 필터링하여 0.4보다 크거나 같은 값을 포함합니다. 그런 다음 PCT 2 열을 필터링하여 0.2보다 작거나 같은 값을 포함합니다. 마지막으로 0.01보다 작거나 같은 값을 포함하도록 P-값 조정 열을 필터링합니다. 이제 Enrichr 웹 기반 보강 분석 도구를 엽니다. 각 클러스터에 대해 차등적으로 발현된 유전자 목록을 별도의 Enrichr 창에 복사하고 분석을 클릭합니다. 그런 다음 분석 출력 위의 세포 유형 탭을 클릭하고 세 개의 선별된 세포 마커 데이터베이스 내에서 상위 5개의 보강에 초점을 맞춥니다. Enrichr 분석의 상위 보강을 기반으로 8개의 클러스터에 가능한 ID를 할당합니다. 클러스터 2와 6을 섬유아세포로 레이블이 지정된 단일 주석으로 결합하고 이러한 주석을 세포 유형이라는 새 메타데이터 변수로 할당합니다. 그런 다음 UMAP 플롯에서 주석이 달린 세포 유형을 시각화하고 일련의 UMAP 플롯에 굵게 표시된 상단 클러스터 마커 유전자의 국소화를 표시합니다. 원래 클러스터 번호로 그룹화된 도트 플롯에서 최상위 클러스터 마커가 차등적으로 발현된 유전자를 시각화한 다음 이번에는 주석이 달린 세포 유형으로 그룹화된 도트 플롯에서 최상위 마커 유전자를 다시 시각화합니다. 시계열 분석을 준비하려면 공간 주석을 제거하고 데이터셋을 단순화합니다. 상처 시간 및 공간 메타데이터를 DPW for Days Post Wounding이라는 새 변수에 재할당합니다. UMAP 플롯에서 새로운 DPW 시간 경과 그룹을 시각화하고 각 DPW 그룹 내에서 각 유형의 셀 수를 보여주는 테이블을 생성합니다. 다음으로, 세포 수를 비율로 변환하여 치유 중 세포 유형 구성의 상대적 변화를 평가하고 각 세포 유형 내에서 각 DPW 범주의 비율을 시각화합니다. 마지막으로, 각 DPW 그룹 내에서 각 셀 유형의 비율을 시각화하고 모든 주석과 필터가 포함된 최종 Seurat 객체를 RDS 파일로 작업 디렉토리에 저장합니다. 데이터 세트의 모든 세포는 UMAP 플롯에서 주요 색상으로 구분된 세포 유형으로 뚜렷하게 클러스터링되어 풍부한 세포 유형 서명을 기반으로 성공적인 주석을 확인했습니다. 상위 클러스터 마커 유전자의 높은 발현은 UMAP 플롯의 해당 세포 유형 클러스터 내에 국한되었습니다. 도트 플롯 시각화는 클러스터 마커 유전자의 가장 높은 발현 수준이 주석이 달린 주요 세포 유형으로 제한됨을 확인했습니다. 누적 막대 플롯은 호중구와 대식세포가 상처 후 첫째 날에 우세한 반면, 섬유아세포, 상피 및 내피 세포는 상처 치유의 알려진 세포 캐스케이드를 반영하여 이후 시점에서 더 널리 퍼졌다는 것을 보여주었습니다.
이 문서는 R을 사용하여 마우스 피부 상처 치유와 관련된 단일 세포 시간 경과 전사체학 데이터세트를 분석하기 위한 종합적인 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 연구자들이 데이터세트 다운로드, 품질 관리, 시각화, 세포 유형 주석을 통해 안내합니다.
Single-cell transcriptomics enables high-resolution mapping of cellular heterogeneity and dynamic cell-cell interactions during tissue repair, directly informing target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine. This protocol operationalizes robust, reproducible workflows for analyzing wound healing datasets, lowering barriers for cross-functional teams to extract actionable insights from complex single-cell data. By standardizing quality control, annotation, and interaction analysis, the workflow enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in early discovery and translational research.
This workflow bridges early discovery, screening, and translational research by enabling standardized single-cell analysis from dataset acquisition to cell-cell interaction mapping.