Name: Mycobacterium smegmatis를 Mycobacteria의 아연 제한 성장 조건에 대한 생물 지표로 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 Mycobacterium smegmatis를 이용한 아연 제한 조건에서 세균 생리학 및 형태 변화 분석 방법. 이 프로토콜은 번역 활성 대체 리보솜 표준화 생산과 재현 가능한 생물 지표 형질을 제공합니다.

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이 연구는 National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, American Lung Association Innovation Award IA -937538 및 National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 to S.P.의 지원을 받았습니다. Allexa D. Burger의 현재 주소는 하와이 호놀룰루, 마노아에있는 하와이 대학교의 Pacific Biosciences Research Center입니다. 미국.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
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<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
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<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
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</ol>

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

Alt-리보솜의 기계론적 토대에 대한 지식 격차에 대한 주요 기여는 시험관 내에서 Zn2+ 제한 조건을 달성하는 것이 어렵다는 것입니다. 실험실 환경에서 미량 Zn2+ 오염은 일반적입니다. 따라서 재현 가능한 Zn2+ 제한 성장 조건을 달성하는 것은 어렵습니다. Zn2+ 오염은 여러 원인에서 발생할 수 있지만 오염 및 변동성의 가장 중요하고 일반적인 원인은 실험기구를 헹구고 배지를 만드는 데 사용되는 초순수입니다. 초순수 시스템은 적절하게 유지 관리되어야 하며 실험기구를 헹구거나 배지에 물을 사용하기 전에 1분 동안 세척해야 합니다. 초순수로 잘 세척하거나 헹구지 않은 플라스크는 Zn2+ 오염을 일으킬 수 있으며, 이는 특정 플라스크의 세포 밀도가 증가하여 분명하지만 동일한 ZLM 배치의 다른 플라스크는 그렇지 않습니다. 새 플라스크를 사용하여 Zn2+ 오염의 원인이 재사용된 플라스크 또는 매체에서 비롯되었는지 평가할 수 있습니다. ZLM의 Zn2+ 오염은 매체를 만드는 데 사용되는 품목의 헹굼을 늘리고 ZLM 준비를 위해 지정된 재료 세트를 사용하여 해결해야 합니다. 이러한 조치 중 어느 것도 예상되는 생물 지표 표현형을 달성하는 데 성공하지 못한 경우, 초순수 및 ZLM의 [Zn2+]를 정량화하여 수원이 Zn2+로 오염되었을 가능성을 배제해야 합니다. 이전에 보고된 바와 같이, ZLM의 [Zn2+]는 115 ± 37 nM23이며, 70 nM 미만 및 150 nM 이상의 농도는 일반적으로 각각 Zn2+ 고갈 및 Zn2+ 오염 표현형으로 이어집니다. 그러나 좋은 배지 준비는 결과에 영향을 미치는 한 가지 요인일 뿐이며, 접종 및/또는 배양의 부적절한 준비, 즉 세척 단계 동안 Zn2+가 풍부한 배지의 디캔팅 불량으로 인해 부적절하거나 과도한 Zn2+가 발생할 수 있습니다. 여기에 포함된 모든 M. smegmatis 배양은 동일한 방식으로 준비되었습니다 - Zn2+ 오염(ZLM-C) 및 Zn2+ 고갈(ZLM-D) 성장 결과가 포함되어 실험이 올바르게 수행된 경우에도 동일한 초순수 시스템을 사용하는 다양한 배지 배치 간에 발생할 수 있는 가변성을 강조합니다.
ZLM에서 세포를 배양하여 재현 가능한 Zn2+ 제한 생체지표 표현형을 생성하도록 하려면 플라스크에 고유하게 라벨을 붙이고, 항상 동일한 조건(즉, ZLM 또는 ZRM)에 사용하고, 여러 번 사용하면서 플라스크를 추적하고, 수명 주기가 끝났거나 ZLM으로 Zn2+ 오염된 생체지표 표현형을 계속 생성하는 플라스크를 폐기하는 것이 중요합니다. 부적절하게 세척된 종자 세포로부터의 Zn2+ 캐리오버는 Zn2+로 오염된 ZLM에서 구문 분석하기 어려울 수 있는 Zn2+ 오염의 일반적인 원인이기 때문에 적절한 접종물 준비는 Zn2+ 제한 성장을 달성하는 데 매우 중요합니다. M. smegmatis 배양은 ZLM(및 병렬로 성장한 ZRM)에서 72시간 성장 후 분석 및 수확해야 합니다. 형태 형성 및 생체 지표 표현형은 48-72시간 동안 발음됩니다. 따라서 Zn2+ 제한에 대해 배양물을 너무 일찍(또는 너무 늦게) 평가하거나 수확하면 완전한 생체 지표 표현형을 산출하지 못할 수 있습니다. Zn2+에서 고갈된 배양은 Zn2+로 오염된 세포 길이와 유사한 세포 길이를 나타냅니다. 따라서 F420 형광과 OD600을 사용하여 둘을 구별해야 합니다. 마찬가지로, Zn2+로 오염된 배양물이 Zn2+ 제한 박테리아보다 항상 더 잘 자라는 것은 아니지만, F420 형광과 야생형 및 ΔaltRP 돌연변이체의 세포 길이는 Zn2+ 제한 조건이 달성되었는지 여부를 밝혀야 합니다.
Zn2+ 제한 배양에서 F420 생체 지표 표현형의 손실이 ZLM에서 성장 8-10일 사이에 두드러지기 때문에 M. tuberculosis의 경우에도 마찬가지입니다. M. tuberculosis는 M. smegmatis와 같은 강력한 Zn2+ 제한 생체 지표 표현형을 나타내지 않지만, 여기에 제시된 성장 방법은 M. tuberculosis의 독성 및 약독화 균주 모두에서 기능 분석 및 전사체학을 사용하여 F420 생체 지표 표현형의 손실을 Zn2+ 제한 성장과 연관시키는 데 사용되었습니다(참고 문헌23및 미공개 데이터). 따라서 F420 형광을 따르는 것은 M. tuberculosis에서 생물학적 Zn2+ 제한 조건을 모니터링하고 검증하는 접근 가능한 방법입니다. Zn2+ 제한 조건 동안 감소된 F420 형광으로 이어지는 메커니즘은 해결되지 않은 상태로 남아 있으며, 감소된 형광이 코엔자임 풀 전체의 풍부도 감소로 인한 것인지 아니면 산화된 형태만이 형광을 방출하기 때문에 산화환원 상태의 이동으로 인한 것인지에 대한 구별도 해결되지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다29.
여기에서 설명한 바와 같이, Zn2+ 제한 배지의 제조는 미묘한 차이가 있으며, 동일한 프로토콜을 따르고 동일한 시약을 사용하는 경우에도 배지에서 Zn2+ 이온의 유효 농도에 영향을 미칠 수 있는 수많은 요인이 있습니다. ZLM의 미량 Zn2+ 는 Zn2+ 제한 표현형의 충분한 성장과 발현을 허용합니다. 제한을 달성하기 위한 Zn2+ 의 이러한 점진적인 감소는 밀폐된 플라스크(30)에서 성장한 박테리아에 의해 산소가 점차적으로 소비되는 저산소증의 웨인 모델과 유사합니다. 저산소증과 Zn2+ 제한 표현형은 모두 박테리아 성장에 의존하기 때문에 산소가 충분하지 않거나 이 모델에서 Zn2+가 접종물 또는 배지에 없으면 박테리아는 관련 형태 형성 프로그램을 거치기 전에 성장을 멈춥니다. 따라서 Zn2+ 오염은 Zn2+ 제한을 달성하고자 할 때 더 명백한 문제이지만, Zn2+ 고갈은 활성 성장 중 성장 장애 및 Zn2+ 의존적 트리거 누락으로 인해 문제가 발생할 수도 있습니다. 또한 형광 강도에 대해 상단 또는 하단 판독 모드와 함께 단색기 또는 필터 기반 플레이트 리더를 사용하면 계산된 F375/420 백분율에 약간의 영향을 미칩니다. 따라서 각 실험실의 값은 여기에 제시된 값과 직접 비교할 수 없지만 유사하고 동일한 추세를 따라야 합니다. 따라서 Zn2+ 제한 성장을 산출하는 ZLM을 만드는 방법 및 절차는 각 실험실 및 초순수 시스템에 최적화되어야 하며, 여기에 제시된 생체 지표 표현형은 Zn2+ 제한 조건을 정의하는 표준으로 사용되어야 합니다.
Zn2+ 제한 성장 조건을 표준화하고 재현하는 것이 어렵기 때문에 Zn2+ 오염을 우회하기 위한 접근 가능한 접근 방식은 Zn2+를 첨가하지 않고 준비된 배지에 킬레이트제를 추가하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 Zn2+ 제한에 대한 진정한 생물학적 반응을 혼란스럽게 하여 종종 Zn2+ 및 기타 미량 영양소에 부족한 환경을 조성합니다. Zn2+ 특이적 킬레이트제조차도 M. tuberculosis23에서 Zn2+ 의존성 전사 반응 외에도 철 결핍에 대한 반응을 상향 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한, 킬레이트제를 사용하려면 Zn2+ 부족 조건에서 Zn2+ 제한 조건으로 전환하는 동안 생물학적 반응을 반영하지 않는 심각한 Zn2+ 부족 환경 또는 자유 Zn2+ 가용성이 제한된 환경에서 지속적인 성장을 피하기 위해 신중한 적정과 타이밍이 필요합니다. 마지막으로, 킬레이트제를 추가하는 것은 다운스트림 응용 분야(예: 대식세포 또는 동물 감염)와 호환되지 않을 수 있습니다. 활발하게 성장하는 배양에서 킬레이트제로 얻은 Alt-리보솜의 형태와 기능과 점진적인 Zn2+ 고갈에 대해 근본적으로 다른 결론이 도출되었습니다17,24. 여기서 강조 표시된 것은 절차가 올바르게 수행된 경우에도 다양한 배지 배치에서 상대적으로 작은 물 순도 차이로 인해 발생하는 다양한 표현형입니다. 여기에 제시된 Alt-리보솜 생성을 위한 정량화, 재현 가능, 생물학적으로 관련된 시스템, 즉 킬레이트제를 추가하지 않고 Zn2+ 제한 야생형 배양에서 대체 리보솜 생물학에 대한 더 나은 이해를 위해 분야 전반에 걸쳐 기여를 통합하는 데 가장 중요한 표준화된 방법을 제공합니다.

아연 이온(Zn2+)은 필수 미량 영양소이며 미생물 배지의 표준 구성 요소입니다. 그러나 많은 박테리아는 Zn2+ 제한 조건이 널리 퍼져 있기 때문에 환경에서 Zn2+ 제한을 견뎌냅니다. soil1, marine2 및 host3 내의 틈새는 종종 Zn2+로 제한됩니다. 따라서 대부분의 박테리아는 Zn2+ 제한을 극복하고 세포 기능을 보존하는 메커니즘을 진화시켰습니다4. Zn2+ 항상성 유지와 관련된 시스템은 엄격한 전사 제어5 하에 있으며 친화성이 높은 Zn2+ 가져오기 시스템을 사용하여 Zn2+를 청소하고, 세포 Zn2+ 매장량을 동원하고, 특정 Zn2+ 결합 단백질을 대체 Zn2+ 독립 paralog6으로 대체하는 데 관여합니다. 후자의 예로는 Zn2+ 독립 리보솜 단백질(RP) 파라로그가 있으며, 이는 bacteria4에서 Zn2+ 반응성 레귤론의 일반적인 특징입니다. 이러한 고도로 발산하는 Zn2+ 독립 RP는 Zn2+ 결합 CXXC 모티프7의 붕괴에 의해 Zn2+ 결합 파라로그와 구별됩니다. 염기서열분석된 원핵생물 게놈의 절반 이상에는 적어도 한 쌍의 중복된 RP가 포함되어 있으며, 그 중 많은 경우 하나의 RP는 Zn2+와 결합하는 반면 파라로그는 그렇지 않습니다8. C+/C- 표기법(시스테인이 풍부한 Zn2+ 결합 모티프의 존재/부재를 나타냄)은 이러한 파라로노시스 RP 쌍과 관련하여 일반적으로 사용되지만7, Zn2+ 독립 RP는 AltRP가 Zn2+에서 리보솜 생물 발생을 위한 대체 RP 역할을 하기 때문에 1차(Prim), Zn2+ 결합 RP 파라로그의 대체(Alt) 버전으로도 설명되었습니다-일부 박테리아에서 제한된 조건이며 검색 가능성이 더 좋은 키워드입니다9,10,11.
AltRP 발현은 Zn2+에 의해 엄격하게 조절되기 때문에 AltRP 발현이 Zn2+ 제한에 직면하여 Zn2+ 의존성 리보솜 단백질에 기능적 중복을 제공한다고 가정하는 것이 논리적입니다. 실제로, AltRP의 이러한 특징은 모델 토양 박테리아 Bacillus subtilis에 대해 입증되었으며, 여기서 Zn2+ 제한 동안 표면 PrimRP L31의 해방 및 AltRP L3112,13으로 대체하여 성장이 구출됩니다. 그러나 일부 AltRP는 코어 PrimRP(예: S14)에 상관관계가 있어 리보솜 생물 발생 중에 통합이 필요함을 의미합니다12,13. AltRP로 리보솜을 재건하는 것은 헌신적이고 에너지 집약적인 프로그램입니다. 이러한 핵심 AltRP는 리보솜에서 Zn2+를 방출하는 역할을 할 수 있지만 일부 AltRP는 Zn2+ 제한된 환경에서 추가 기능을 진화시켰을 수도 있습니다. 이것은 AltRP가 paralogous PrimRPs와 갈라진다는 관찰에 의해 뒷받침됩니다. AltRP 유전자의 서열 상동성은 종종 동일한 종 내의 Zn2+ 결합 PrimRP 유전자 서열보다 다른 종의 상동체에서 더 높습니다7,10. 고도로 발산하는 AltRP를 암호화하는 유전자는 Zn2+ 의존적 전사 제어 하에 있기 때문에 엄격하게 조절되고 고도로 보존된 리보솜 superoperons에 가해지는 선택적 압력에서 제거됩니다14. 리보솜 기계와 AltRP를 암호화하는 유전 정보에 대한 분리된 선택적 압력은 이러한 RP를 상동 PrimRP와 다른 진화 궤적에 노출시키고 다른 박테리아에서 동일한 AltRP의 계통 특이적 진화를 허용할 수 있습니다10,15. 박테리아에 AltRP가 널리 존재하고 이러한 고유한 RP의 분리된 유전적 조절은 AltRP를 박테리아 리보솜에 통합하면 AltRP 함유 리보솜(Alt-리보솜)에 특별한 특성을 부여하는지에 대한 흥미로운 질문을 제기합니다.
Mycobacteria는 Alt-ribosomes의 기계론적 특성을 조사하기 위한 이상적인 박테리아 그룹입니다. 첫째, 마이코박테리아는 AltRP를 암호화하는 4개의 유전자(S14-2, S18-2, L28-2 및 L33-2)를 포함하는 고도로 보존된 altRP 오페론을 가지고 있습니다8,9. Mycobacterial AltRP는 PrimRP paralog와 크게 다릅니다. 4개의 PrimRP/AltRP 쌍 모두에서 주어진 AltRP 유전자는 동일한 종의 PrimRP 유전자보다 모든 마이코박테리아 종에서 더 유사합니다10. AltRP의 계통 특이적 진화는 Mycobacteria 내에서도 뚜렷하게 나타나며, Mycobacterium tuberculosis 및 M. bovis의 AltRP S18-2 및 L28-2에 의해 입증되었으며, 이는 다른 mycobacteria10에는 존재하지 않는 C-말단에 고유한 서열을 포함합니다. 둘째, 관련성이 높은 이 박테리아 그룹은 토양(예: M. smegmatis)에서 인간(예: M. tuberculosis), 소(예: M. bovis), 수생(예: M. marinum) 및 조류(예: M. avium)에 이르기까지 다양한 환경에 서식하는 비병원성 및 병원성 구성원을 포함합니다. 마이코박테리아에서 altRP 오페론의 고도로 보존된 특성, 특정 AltRP 유전자의 계통 특이적 진화 및 이 그룹의 구성원이 존재하는 매우 다른 환경은 AltRP 기능의 보존되고 계통 특이적 진화와 Alt-리보솜의 기계론적 특성을 분석할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 원핵 생물 게놈에 AltRP가 풍부함에도 불구하고 AltRP 및 Alt-리보솜의 역할은 소수의 박테리아에서만 조사되었습니다9,10,11,12,13,16,17,18,19. 마이코박테리아에서 Zn2+ 제한 성장 조건을 검증하기 위한 특정 지표로 표준화된 시스템을 구축하면 실험 결과가 향상되고 리보솜 연구 분야에서 Alt-리보솜에 대한 이해가 증진될 것입니다.
Zn2+는 미량 영양소입니다. 따라서 화학 물질 및 물에서 Zn2+를 오염시키는 미량은 배지 준비에서 생략 된 경우에도 Zn2+의 생체 이용률에 기여합니다. 물이나 화학 물질에 존재하는 미량의 Zn2+는 실험실마다 크게 다를 수 있으므로 Zn2+ 제한 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 각각의 독립적인 배지 준비에서 [Zn2+]를 경험적으로 정량화하는 것은 일상적인 성장 분석을 수행하는 대부분의 실험실에서 지나치게 부담스럽지만, 성장 배지에서 Zn2+ 오염 가능성을 제거하는 메커니즘은 본질적으로 가치가 있습니다. 이를 위해 M. smegmatis 및 M. tuberculosis에서 Zn2+ 제한 성장 및 Alt-리보솜 생산을 위해 화학적으로 정의된 Zn2+ 제한 배지(ZLM), 성장 용기 및 종자 배양을 준비하는 자세한 방법이 여기에 제시되어 있습니다. ZLM에서 성장한 후 주요 형태 형성 특성(OD600으로 측정한 세포 밀도, 세포 길이 및 코엔자임 F420의 형광)을 사용하여 Zn2+ 제한이 달성되었음을 확인했습니다. 코엔자임 F420은 메탄겐 및 마이코박테리아의 이화작용 및 산화 스트레스에 대한 방어에 중요한 역할을 하는 데아자플라빈 보조인자입니다20,21. 중요한 것은 마이코박테리아는 이 보조인자22가 풍부하기 때문에 420nm에서 여기될 때 자가형광을 띱니다. [Zn2+]와 F420 형광 사이의 분자 연결은 해결되지 않은 상태로 남아 있지만, 배양에서 F420 형광을 따르는 것은 다루기 쉽고 신뢰할 수 있는 생물 지표입니다.
M. smegmatis에서 생물지표 표현형은 야생형 박테리아에서 발생하지만, altRP 오페론이 결핍된 결실 돌연변이는 동일한 형태형성 프로그램을 거치지 않으며 차등 생물지표로 사용될 수 있습니다10. M. tuberculosis는 Zn2+ 제한 기간 동안 M. smegmatis와 동일한 형태 생성 프로그램을 따르지 않지만, M. tuberculosis는 Zn에 대해 강력하고 전반적인 반응을 보입니다2+ 제한 사항 및 이 방법을 따르는 주요 생물 지표 표현형23. 따라서 여기에 정의된 시스템은 동일한 성장 조건(즉, Zn2+ 제한)에서 Prim- 및 Alt-리보솜을 생성할 수 있도록 하여 Alt-리보솜 기능의 기계론적 해부와 박테리아 생리학을 형성하는 데 있어 그 역할을 촉진합니다. 이 성장 방법은 활성 Alt-리보솜의 구조를 해결하고 야생형 M. smegmatis24에서 번역 활성을 입증하는 데 사용되었습니다. 이 성장 방법 및 생물 지표 표현형이 Zn2+ 제한 동안 AltRP의 생물학적 기능을 강조한다는 것을 더욱 뒷받침하는 것으로, AltRP 발현은 Zn2+ 의존 형태 형성에 필요하며 Zn2+ 제한 M의 전사체 및 단백질체에 지대한 영향을 미칩니다. smegmatis10,25. 접종량과 배양 시간을 약간 수정한 동일한 방법을 사용하여 M. tuberculosis">9,23의 Zn 2+ 제한 배양을 생성합니다. 여기에서는 M. smegmatis와 M. tuberculosis 모두에서 Zn2+ 제한 성장을 달성하기 위한 프로토콜 및 생물지표 표현형이 자세히 설명되어 있으며, 이 박테리아는 배지의 Zn2+ 오염에 더 민감하고 느리게 성장하는 병원체보다 더 광범위하게 접근할 수 있기 때문에 M. smegmatis에 중점을 둡니다.

<table><tbody><tr><td>1000 mL 진공 여과 시스템, 표준 라인</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyer Shaker Flasks</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 배양 튜브, 플라스틱, 이중 위치 캡 포함</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Shaker Flasks</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Lab Binocular Biological Compound 현미경</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 바이오 반응 튜브, 멸균</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>플래그 캡이 있는 50 mL 고성능 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet 저발포 분말 세제</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 철 (III) 시트레이트, 갈색</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, 1M 해결책의 경우 5 mL 초순수에 1.325 g를 추가하십시오; 4 C에 빛에서 보호된 상점</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 D-판토텐산</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>무수 구연산, 결정질</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>세포 밀도 및 Bradford 분석 측정을 위한 DiluPhotometer OD600</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL 마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td></td><td>단종</td></tr> 글리<tr><td>세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파라긴</td><td>써모 사이언티픽</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD 카메라</td><td>옵트로닉스</td><td></td><td>올림푸스 현미경과 함께 사용</td></tr><tr><td>: 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>제품 생산 중단, Moticam X5 Plus로 대체되었습니다. 복합 현미경과 함께 사용</td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 정립 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>단종, BX53M</td></tr><tr><td>인산칼륨, 단염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Micro 양면 일회용 플라스틱 큐벳</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 크리스탈</td><td></td><td>VWR VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>황화아연 헵타하이드레이트, 결정질/ACS</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium smegmatis를 mycobacteria의 아연 제한 성장 조건에 대한 생물 지표로 사용

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

많은 박테리아는 Zn2+ 결합 리보솜 단백질을 Zn2+ 독립 파라로그로 대체하여 Zn2+ 제한 성장 조건에서 대체 리보솜을 구축합니다. 이러한 대체 리보솜을 연구하기 위한 시스템을 정의하는 것은 실험실에서 Zn2+ 오염이 흔하기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 킬레이트제가 성장 배지에 첨가되는 경우가 있지만, 이 접근법은 점진적인 Zn2+ 제한에 대한 생물학적 반응을 복잡하게 만들고 리보솜 동면과 관련이 있습니다. 여기에서는 킬레이트를 추가하지 않고 Zn2+ 제한 성장을 위한 배지 준비 및 파종 배양에 대한 자세한 지침을 설명합니다. 이 방법에 따라 모델 박테리아인 Mycobacterium smegmatis는 대체 리보솜에 의존하는 형태 형성을 거칩니다. 형태형성은 다루기 쉽고 Zn2+ 제한 조건에서만 발생하기 때문에 M. smegmatis는 생물학적으로 관련된 성장 조건을 확인하기 위한 생물 지표로 사용할 수 있습니다. 야생형에서 Zn2+ 제한을 나타내는 세 가지 생물지표 표현형(세포 밀도, 세포 길이 및 코엔자임 F420 형광)을 설명하고, 선택적 리보솜을 만들 수 없는 결실 돌연변이에 대한 이러한 생물지표의 변화를 설명합니다. 미량 Zn2+ 오염은 각 배지 배치에 대해 제어하기 어렵고 각 배지 준비에서 Zn2+의 정확한 정량화가 지나치게 부담스럽기 때문에 이 생물지표 표현형을 따르는 것이 Zn2+ 제한 성장 배지의 준비를 검증할 수 있는 접근 가능한 방법입니다. Zn2+ 제한 성장 및 대체 리보솜 생산에 대한 적절한 조건을 식별하는 데 도움이 되도록 Zn2+ 오염 또는 Zn2+ 고갈 처리된 Zn2+ 제한 배지 제제에 대해서도 생물 지표 표현형의 변화를 프로파일링했습니다. M. tuberculosis에서 Zn2+ 제한 성장 및 대체 리보솜 생산을 달성하기 위한 추가 세부 정보가 관련 생물지표 표현형과 함께 제시됩니다. 전반적으로, 여기에 설명된 자세한 지침과 생물지표 표현형은 마이코박테리아에서 번역 활성 대체 리보솜의 생산을 표준화하는 데 도움이 될 것입니다.

~의 생물지표 표현형 M. smegmatis 
야생형 M. smegmatis ZLM 배지에서 배양되어 Zn 농도에 도달한 배양물2+-Zn 조건에서 배양된 세포와 비교했을 때, 성장을 제한하는 조건에서는 세 가지 주요 생물지표 표현형이 나타납니다.2+-충분 조건: [1] OD 감소600, [2] 세포의 신장, 그리고 [3] 420 nm에서의 피크 형광 감소. AltRP가 결핍된 돌연변이체(ΔaltRP)은 동일한 Zn을 가지고 있지 않습니다2+야생형과 동일한 -의존적 형태 형성10, 및 Zn에서의 독특한 표현형2+제한 배지는 감별 생물지표로 사용될 수 있습니다. 따라서 세 가지 생물지표 측정값 모두를 먼저 ZRM 및 ZLM에서 배양된 야생형에서 평가해야 합니다. 만약 예상되는 Zn2+-제한된 야생형 표현형이 관찰되면, ΔaltRP 그 후 결손 균주를 평가해야 합니다. ZLM에서의 성장이 항상 Zn 수치에 도달하는 것은 아닙니다.2+제한된 조건이며, 이것이 바로 생물지표(bioindicator)가 필요한 이유입니다. 독특한 야생형 및 ΔaltRP 생물지표 표현형은 생물학적으로 유의미한 Zn의 존재를 검증합니다.2+-제한 조건이 달성되었습니다. ZLM 배지에서 배양된 배양물이 Zn 제한 조건에 도달하지 못할 때...2+-Zn으로 인한 성장 제한2+ 배지나 배양 용기의 오염(ZLM-C)이 있는 경우, 다음에서 보여주는 바와 같이 이러한 생물지표 표현형은 덜 뚜렷하게 나타납니다. 그림 1 및 그림 2반대로, Zn의 농도가2+ ZLM 내 Zn 농도가 너무 낮으면 Zn에 의해 성장이 저해됩니다.2+ 낮은 배양 탁도와 변화된 생물지표 표현형에서 뚜렷하게 나타나는 고갈(ZLM-D)에 대해서는 다음에서도 자세히 다루고 있다. 그림 1 그리고 그림 2.
세포 밀도는 Zn의 강력한 지표입니다.2+ 한계점. ZRM에서 배양된 배양물은 지속적으로 높은 탁도(OD 이상)에 도달합니다.600 5) 72시간 후, 응집 현상이 나타날 수 있으며 ZLM에서 배양한 배양물보다 눈에 띄게 더 노란색을 띱니다(데이터 미제시).그림 1A). Zn2+ 제한 요인이 성장을 억제함(OD 감소로 표시됨)600Zn와 비교했을 때 모든 균주의)2+-충족 조건 및 ΔaltRP 균주는 야생형보다 세포 밀도가 낮습니다.그림 1A). Zn2+ZLM에서의 성장을 제한하면 일관되게 특정 OD 값이 산출됩니다.600 야생형에서는 3.5 초과 5 미만이며, Δ에서는 3 미만입니다.altRP 균주 (그림 1A). Zn이 포함된 ZLM에서 배양된 배양물은2+ 오염(ZLM-C)군이 유사한 세포 밀도(OD600 5) 이상은 Zn으로 이동합니다.2+-ZRM에서 배양된 충분한 영양 상태의 배양물 (그림 1A). 만약 [Zn2+ZLM 내의 Zn 농도가 너무 낮으면, 배양액의 Zn이 심하게 고갈될 것입니다.2+ (ZLM-D)이며, 야생형 배양액의 세포 밀도 감소(OD600 3 미만입니다; 그림 1A). 야생형 세포 밀도 (3.5 &lt; 광학 밀도(OD)600 &lt; 5) Zn을 확인하기 위한 첫 번째 생물지표 표현형 체크포인트가 되어야 합니다.2+-제한 조건. 예상 세포 밀도까지 성장한 야생형 배양물만 고려해야 하며, Δ의 분석은altRP Zn 검증이 변형(strain) 확인보다 우선되어야 합니다.2+- 야생형에서의 제한된 생물지표 표현형.
Zn2+가 제한된 ZLM에서 배양된 정지기 야생형 배양물은 평균 세포 길이가 약 9 µm로 신장되는 반면, ZRM에서 배양된 Zn2+ 충족 배양물은 평균 세포 길이가 약 3 µm로 짧습니다 (Figure 1B). Zn2+ 오염이 있는 ZLM(ZLM-C)에서 배양된 야생형 배양물은 완전히 신장되지는 않으나, 평균 세포 길이가 5 µm로 Zn2+ 충족 세포보다 약간 더 깁니다. ZLM 전체 배치에서의 Zn2+ 오염 생체지표는 준비 과정 중의 오염 가능성을 나타내며, 개별 배양물(즉, 플라스크)에서의 오염은 플라스크 세척 불량 또는 배양 준비 과정의 오염을 나타냅니다. Zn2+가 심하게 결핍된 ZLM(ZLM-D)에서 배양된 야생형 배양물은 신장이 덜 뚜렷하며 평균 세포 길이는 약 7 µm입니다 (Figure 1B). 신장된 야생형 표현형은 ΔaltRP 균주에서는 관찰되지 않으며, Zn2+가 제한된 ΔaltRP 세포의 평균 세포 길이는 약 5 µm입니다 (Figure 1B). Figure 2는 서로 다른 ZLM 또는 ZRM 조제물(단계 2 이후)에서 배양되어 복합 광학 현미경으로 시각화한 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 단계 4 이후, Figure 2와 같이 나타난 이미지의 수많은 시야에서 얻은 세포들을 사용하여 Figure 1B에 제시된 배양물의 평균 세포 길이를 계산합니다. 야생형의 신장된 표현형은 Zn2+ 제한 조건에 특이적이며, 배양물이 Zn2+ 충족 상태이거나 Zn2+가 심하게 결핍된 경우에는 세포 신장이 관찰되지 않습니다 (Figure 1B 및 Figure 2).
감소된 F420 형광 바이오인디케이터 표현형은 형광 스캔에서 가장 잘 관찰됩니다 (그림 1C). 보조인자 F420의 형광 감소는 단계 3.16.5에 설명된 대로 375 nm(배경) 대비 420 nm(보조인자 F420의 자가형광)의 형광 강도 백분율을 측정하여 정량화하며, 이를 F375/420로 나타냅니다. 형광 스캔 기능이 없는 단색 플레이트 리더기의 경우, 375 nm와 420 nm(두 경우 모두 방출 파장은 475 nm)에서 지점 측정을 수행하여 F375/420을 계산하는 것이 적합합니다. Zn2+ 충분 조건(즉, ZRM)에서 배양된 야생형 배양물은 약 17%의 매우 재현성 있는 F375/420 값을 가집니다 (그림 1D). ZLM에서 배양된 Zn2+ 제한 배양물에서 F420 형광의 감소는 F375/420 값이 약 27%로 증가하는 것으로 나타납니다 (그림 1D). Zn2+ 제한 조건의 ΔaltRP 균주에서 F420 형광은 동일 조건의 야생형보다 현저히 낮으며, 이는 형광 스캔에서 시각적으로 분명하게 확인됩니다 (그림 1C). Zn2+ 제한 ΔaltRP 균주의 F375/420은 약 50%-80%의 범위로 변동성이 더 큽니다 (그림 1D). ZLM에서 배양되었으나 Zn2+ 오염의 바이오인디케이션을 보이는 배양물(ZLM-C)은 F375/420 값이 약 21%로 감소하며, Zn2+ 고갈 배양물(ZLM-D)은 F375/420 값이 약 35%입니다 (그림 1D).
요약하자면, ZLM에서 배양된 균주의 Zn2+-제한 상태를 확인하기 위해 야생형 및 ΔaltRP 균주에서 세 가지 생물지표 표현형을 평가해야 합니다. 생물학적으로 유의미한 Zn2+-제한 성장을 위한 생물지표는 다음과 같아야 합니다: [1] 야생형의 OD600은 3.5 - 5이며, ΔaltRP 균주는 3 미만, [2] 야생형 세포의 길이는 약 10 µm이며, ΔaltRP 세포는 그 절반의 길이, [3] ΔaltRP 균주의 F375/420 수치가 50% 이상으로 높아야 합니다.
의 생물지표 표현형 M. tuberculosis 
아연2+제한됨 결핵균(M. tuberculosis) ~와 동일한 형태 형성 프로그램이 나타나지 않는다 M. smegmatis구체적으로, OD 값에는 차이가 없습니다.600 Zn 사이의2+-충분한 양의 Zn 및 Zn2+-제한 배양, 및 Zn2+제한된 배양군에서는 뚜렷한 형태학적 표현형이 나타나지 않았으며, 즉, 세포 신장이 일어나지 않았다.23마찬가지로, Zn은 존재하지 않습니다.2+-결핍된 생물지표 표현형(즉, 세포 밀도 감소)이 나타나는 M. tuberculosis ~에서 관찰되는 바와 같이 M. smegmatis아연2+Zn 제한 배양액은 Zn 충분 배양액에 비해 뭉침 현상이 더 뚜렷하게 나타납니다.2+-충분한 배양액의 경우, 두 조건 모두 10일째에 상당히 덩어리지는 현상이 관찰되었습니다(Mtb-H37Rv와 Mtb-Aux 모두에서 관찰됨). Zn에 대한 핵심 생체지표 표현형은2+ ~의 제한점 *M. tuberculosis* 피크 F가 감소되었습니다420 이전 보고와 같이 형광23응집을 최소화하기 위해 10일 대신 8일 동안 배양한 결과가 여기에 제시되었습니다. 감소된 F420 Zn에서 형광이 나타납니다.2+-단색광과 (그림 3) 및 필터 기반 플레이트 리더입니다. 필터 기반 플레이트 리더의 경우, Mtb-H37Rv, Zn2+-제한된 배양물(즉, ZLM에서 배양됨)은 Zn 배양물 대비 약 50%의 원시 형광 값을 나타냅니다.2+-충분한 배지 배양액(즉, ZRM에서 배양; 데이터는 제시되지 않음). 단색 플레이트 리더기의 바닥 읽기 모드와 Mtb-Aux, Zn를 사용하여2+-충분한 영양 배지(replete cultures)에는 F가 포함되어 있습니다.375/420 약 75%이며, Zn2+- 오염된 ZLM 배양액은 유사한 값을 나타냅니다. F의 감소420 Zn의 형광2+ZLM에서 배양된 제한 배양액은 F로 나타난다.375/420 100% 이상의. Zn2+-제한적 ΔaltRP 균주는 유사한 성장 및 F를 나타냅니다.420 Zn에서 관찰되는 형광2+-제한된 야생형-그림 3)이며, 다음의 생물지표로는 유용하지 않습니다. M. tuberculosis ~에 있는 그대로 M. smegmatis (그림 1). 따라서 배양에 사용할 배지를 테스트하는 것이 권장됩니다. M. tuberculosis 빠르게 성장하는 *M. smegmatis*
<img alt="박테리아 연구에서의 성장 곡선, 길이 분포 및 형광 분석; 그래프 및 박스 플롯." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1~의 생물지표 표현형 M. smegmatis Zn 조건에서 배양된2+ Zn의 제한 및 효과2+ 오염 및 Zn2+ 표현형에 미치는 고갈 효과. 각 패널에 제시된 생물지표 표현형의 대표적인 예시는 동일한 배양액의 72시간째 모습입니다. Zn의 예시는2+-오염된 (ZLM-C), Zn2+-제한(ZLM-L) 및 Zn2+-결핍(ZLM-D) 성장 결과는 본문에 제시된 것과 동일한 조제 방법(단계 2)을 따른 독립적인 배지 조제분에서 얻은 것입니다. Zn-결핍의 대표적인 표현형은2+제한된 야생형 및 Δ대체적 RNA 중합효소(altRP) 균주들은 동일한 배치의 ZLM에서 유래하였습니다. 모든 균주와 조건은 3개의 생물학적 반복구(n=3)를 가집니다. (A) 600 nm에서 측정된 광학 밀도(OD)를 나타내는 성장 곡선600) 및 Zn에 따른 세포 밀도 감소2+ 제한 및 고갈. 오차 막대는 반복 실험 간의 표준 편차를 나타낸다. (B) 야생형 및 Δ의 세포 길이altRP Zn의 신장된 표현형을 나타내는 균주들2+-제한된 야생형. 박스-수염 그림은 다음의 세포 길이의 사분위 범위, 최소값, 최대값 및 중앙값을 보여준다. µm. (C) 피크 F가 감소한 배양액의 대표적인 형광 스캔 결과420 Zn을 이용한 형광 분석2+ 제한 및 감소된 F420 Zn에서의 형광2+-제한적 ΔaltRP 균주. 각각의 서로 다른 배지 조제 조건에서 생물학적 반복 실험(biological triplicates) 중 하나의 대표 배양 결과만을 나타내었다. 형광 스캔은 5 nm 단계 크기로 230 nm에서 440 nm까지의 들뜸 파장 범위를 사용하였으며, 방출 파장은 475 nm로 설정하였다. 왼쪽 상단에 표시된 삽입 패널은 Zn의 확대 보기이다.2+-제한된 야생형 및 ΔaltRP Zn 영역에서 420 nm의 감소된 형광 피크를 강조하기 위한 균주들2+-제한 ΔaltRP 변형률. 축 단위는 메인 그래프와 동일함. 모든 범례는 (A)와 동일함. (D) 보조인자 F의 감소된 형광 정량 분석420, F의 백분율로부터 계산된375/420백분율은 (C)의 형광 스캔에서 얻은 값으로부터 계산되었습니다. 박스 플롯(Box and whisker plot)은 사분위 범위, 최소값, 최대값 및 중앙값 백분율을 나타냅니다. Zn을 나타내는 약어는2+-배지 유형 뒤의 괄호 안에 제공된 배지의 관련 상태는 R = Zn입니다.2+-충분, C = Zn2+-오염된, L = Zn2+-제한적이며, D = Zn2+-결핍, 기타 약어는 다음과 같다: WT = 야생형 균주, a.u. = 임의 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Zn²⁺ 상태 전기영동 결과, WT 대 ΔaltRP, 단백질 분리 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 2"> 
그림 2: 72시간째 M. smegmatis의 대표적인 현미경 이미지. 사진은 그림 1에 표시된 배양액에서 촬영되었습니다. 세포는 100x 오일 침강 렌즈를 사용하여 총 1000x 배율의 복합 광학 현미경으로 촬영되었습니다. 스케일 바는 10 µm입니다. 배지 유형 뒤 괄호 안에 표시된 배지의 Zn2+ 관련 상태를 나타내는 약어는 다음과 같습니다: R = Zn2+-충분, C = Zn2+-오염, L = Zn2+-제한, D = Zn2+-결핍, 그리고 기타 약어는 다음과 같습니다: WT = 야생형 균주. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="형광 여기 스펙트럼 차트; 파장 대 형광; 단백질 연구 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: 보조영양성 Mtb mc26206 (Mtb-Aux)의 대표적 형광 스캔으로 입증된 Zn2+-제한 M. tuberculosis에서 F420 바이오인디케이터 표현형의 소실. Zn2+-오염 및 Zn2+-제한 성장 결과의 예시는 독립적인 배지 조제물로부터 얻은 것입니다. Zn2+-제한 야생형 및 ΔaltRP 균주는 동일한 배치(batch)의 ZLM에서 유래했습니다. 모든 균주와 조건은 3개의 생물학적 반복 실험(n=3)을 수행하였습니다. 그래프에는 서로 다른 배지 조제물 및 균주의 생물학적 3중 반복 실험 중 하나의 대표 배양액만 표시되었습니다. 형광 스캔은 8일간의 성장 후 바닥 읽기 모드를 사용하여, 여기 파장 범위 230 nm에서 440 nm까지 5 nm 단계 크기로, 방출 파장은 475 nm로 측정되었습니다. 배지 유형 뒤 괄호 안에 제공된 배지의 Zn2+ 관련 상태를 나타내는 약어는 다음과 같습니다: R = Zn2+-충분(replete), C = Zn2+-오염(contaminated), L = Zn2+-제한(limited), D = Zn2+-고갈(depleted)이며, 기타 약어는 다음과 같습니다: WT = 야생형 균주, a.u. = 임의 단위(arbitrary units). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 마이코박테리아에서 Zn2+ 제한 리보솜을 생성하기 위한 Zn2+ 제한 배지, 성장 혈관 및 종자 배양의 준비를 자세히 설명합니다. Zn2+의 흔적은 Zn2+ 제한 성장으로 이어지며 모델 박테리아, Mycobacterium smegmatis 및 인간 병원체 M. tuberculosis에서 체외에서 Zn2+ 제한을 확인하기 위한 생물 지표로 사용되는 형태 생성 특징을 설명합니다.

Mycobacterium smegmatis를 Mycobacteria의 아연 제한 성장 조건에 대한 생물 지표로 사용

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

출처: Gupta, S., et al. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 철분 제한 조건에서 결핵균 을 배양하여 철분 스트레스를 유도하고 박테리아 생존을 지원하는 시데로포어의 분비를 촉진하는 절차를 보여줍니다.

철분 제한 조건에서 결핵균 배양

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

c harcoal agar resazurin assay(CARA)는 복제, 비복제 또는 둘 다인 마이코박테리아에 대한 테스트 에이전트의 활성을 평가하기 위한 반정량, 중간 처리량 방법입니다.  CARA를 사용하면 시간 및 농도에 따른 활성을 신속하게 평가할 수 있으며 CFU(Colony Forming Unit) 분석을 통해 추적할 매개변수를 식별할 수 있습니다.

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결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

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이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

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CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

Mycobacterial 병원성 전략이 제대로 이해 남아있다. 대부분의 종의 느린 성장 속도, 세포 벽 뚫리지 자연과 병원균 작업의 위험이 연구 mycobacteria 어렵게하고 이러한 생물 우리의 가난한 이해하기위한 대부분 책임이 있습니다. 이 비디오에서 우리는 DNA의 항목을 허용하는 간단한 높은 전기 충격을 쓰는 세포를 포함 electroporation의 기술을 보여줄 것입니다. 그것은 mycobacterial 세포에 DNA를 도입을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다.

Mycobacteria의 Electroporation

학습하세요 Mycobacterium smegmatis를 이용한 아연 제한 조건에서 세균 생리학 및 형태 변화 분석 방법. 이 프로토콜은 번역 활성 대체 리보솜 표준화 생산과 재현 가능한 생물 지표 형질을 제공합니다.

Mycobacterium smegmatis를 Mycobacteria의 아연 제한 성장 조건에 대한 생물 지표로 사용

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