Name: 발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 학습하세요 제브라피시 유충에서 two-photon 레이저 매개 절제를 이용한 골재생 및 면역 반응 연구 방법을. 이 기술은 조골세포 재생 메커니즘 규명에 활용됩니다.

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연구 프로토콜은 Landesdirektion Sachsen의 승인을 받았으며 허가 번호는 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87입니다. 사용된 제브라피시 균주는 국내법에 따라 그리고 앞서 설명한 바와 같이 표준화된 조건 하에서 유지되었다27,28. 연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 재료 및 용액의 준비
<ol><li>배아를 1x E3 배지에서 유지합니다. 170mL의 60x E3 스톡을 탈이온수 10L에 희석하고 2mL의 0.1% 메틸렌 블루를 첨가하여 1x E3 배지를 준비합니다.<ol><li>탈이온수 30L에 NaCl 17.2g, KCl 0.76g, CaCl2·2 H2O 2.90g, MgSO4·7 H2O 4.90g을 혼합하여 1x E3 미디어 스톡을 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유충 매립을 위해 1% 저융점 아가로스(LMA)의 부분 표본을 미리 준비하고 실온에서 보관하십시오.<ol><li>부분 표본을 준비하려면 LMA를 1x E3 매체에 용해시키십시오(예: 삼각 플라스크에 있는 1x E3 50mL에 LMA 500mg을 넣고 용액을 전자레인지에서 아가로스가 완전히 용해될 때까지 가열한 다음 1.5mL 튜브의 1mL 부분 표본에 분주합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 제브라피시 사육 및 배아 채취
참고: 커밋된 조골아세포[osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 및 대식세포[mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]의 존재를 보고하는 이중 형질전환 제브라피시 유충이 여기에사용되었습니다 (그림 1A).
<ol><li>짝짓기 전날 저녁에 표준 짝짓기 케이지에서 원하는 단일 전이유전자를 가진 부모 제브라피시를 설정합니다. 참고: 표준 짝짓기 케이지를 사용하면 알이 부모 제브라피시가 도달할 수 없는 아래쪽 구획으로 통과할 수 있습니다.<ol><li>짝짓기 케이지의 칸막이를 사용하여 짝짓기를 할 때까지 수컷과 암컷을 분리하십시오. 다음날 아침에 칸막이를 제거하여 짝짓기를 시작하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>늦어도 정오에는 번식 탱크에서 부모 제브라피시를 제거하고 배아를 수집하여 체를 통해 짝짓기 케이지의 물을 걸러냅니다. 참고: 유충의 정확한 나이가 결정적인 경우, 약 30분 간격으로 배아를 채취하십시오. 클러치 메이트는 다른 실험 그룹과의 실험에 사용해야 합니다.</li>
	<li>배아를 1x E3 배지가 들어 있는 직경 100mm 접시에 넣고 28°C31의 인큐베이터에 보관합니다.</li>
	<li>실체현미경의 도움으로 플라스틱 피펫을 사용하여 접시에서 수정되지 않은 난자와 죽은 배아를 제거하고 매일 1x E3 매체를 교체합니다.</li>
	<li>실험 전에 형광 실체현미경을 사용하여 리포터 전이유전자에 대해 양성인 유충을 분류합니다.</li>
</ol>3. 저융점 아가로스에 박힌 유충
<ol><li>LMA 부분 표본을 써모블록 또는 65°C의 수조에서 녹입니다. LMA가 녹으면 매립될 때까지 42°C에서 유지합니다(그림 1B). 녹인 LMA 부분 표본 1mL에 0.4% MS-222 50μL를 첨가하여 마취를 위한 0.02% MS-222 농도를 얻습니다.</li>
	<li>0.02% MS-222 E3 배지에서 4 dpf(수정 후 일수) 유충(또는 더 오래된 유충)을 마취합니다.</li>
	<li>3mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취된 유충을 유리 바닥 마이크로웰 접시로 옮기고 동일한 피펫으로 과도한 E3 매체를 제거합니다(그림 1B). 유충이 마르지 않도록 하십시오. 알림: 하나 이상의 유충이 동시에 접시에 박힐 수 있습니다. 배치에 충분한 시간을 허용하기 위해 3-5 마리의 유충을 포함하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>수조/써모블록에서 녹은 LMA 아가로스를 가져와 LMA의 (냉각) 방울을 접시에 넣고 유충이 있는 유리 바닥을 덮습니다. LMA는 너무 뜨겁지 않지만 여전히 액체입니다.</li>
	<li>그런 다음 아가로스가 응고되기 전에 유충을 원하는 측면 위치에 놓습니다. 여기에서 역현미경 설정을 위한 준비로 조작부가 접시의 유리 바닥에 최대한 가까운 측면 위치를 확인하십시오(그림 1B).</li>
	<li>아가로스를 응고시킨 다음 E3 매체(최대 0.02% MS-222 포함)를 접시에 추가하여 아가로스가 건조되지 않도록 합니다(그림 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> 그림 1: 임베딩 절차의 개략도. (A) 이중 유전자 변형 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 녹색으로 표시된 외골세포와 빨간색으로 표시된 대식세포가 있는 제브라피시 유충을 사용했습니다. (B) 프로토콜의 3단계에서 설명한 대로 임베딩 절차의 작업 흐름. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 유충의 생체 내 이미징 및 레이저 절제
<ol><li>형질전환 제브라피시 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, 25x/0.95 수성 대물렌즈 또는 이와 동등한 설정이 있는 도립 이광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다.</li>
	<li>유충이 박힌 접시를 도립 현미경의 현미경 스테이지에 놓고 절제를 위해 원하는 영역을 시야 중앙에 배치합니다. opercle는 GFP 형광 신호의 도움으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.</li>
	<li>opercle이 현미경의 시야에서 초점이 맞춰지고 중앙에 배치되면 z-stack 설정(종종 1-2μm z 간격이 사용됨)을 선택하여 opercle의 전체 너비를 이미지화합니다. 동시에 절제할 특정 z 평면의 영역(일반적으로 opercle의 후방 영역)을 선택합니다. 이광자 레이저 어블레이션은 이 평면에서만 발휘됩니다. 참고: z 차원의 해상도가 높을수록 이미징 시간이 길어지지만 나중에 수집된 데이터의 체적 분석을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>절제 전에 관심 영역을 이미지화합니다. GFP 검출의 경우 488nm의 백색광 레이저와 495nm에서 550nm 또는 이와 동등한 범위의 하이브리드 검출기를 사용하십시오. 하이브리드 검출기(또는 이와 동등한 검출기)에서 595 - 780 nm의 mCherry 검출 범위를 가진 555 nm(백색광 레이저) 여기를 사용하여 대식세포를 이미징합니다.<ol><li>좋은 품질/시간 비율을 위해 이미지 형식 512 x 512를 사용합니다(더 높은 해상도 또는 더 빠른 속도가 필요한 경우 다른 형식을 사용할 수 있음). 참고: 현미경에 설치된 온도 제어 인큐베이터를 사용하여 예를 들어 28°C까지 조정 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>선택한 2D 평면에 직경이 25μm(실험에 따라 다른 모양과 크기를 선택할 수 있음)의 원형 영역을 그리고 ROI 도구를 사용하여 조작부에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>절제를 수행하려면 450mW에서 절제력(대물렌즈 없이 측정)을 적용하고 선택한 영역을 400Hz의 스캔 속도와 총 10초의 지속 시간으로 이광자 레이저에 노출시킵니다. 절제 중에는 401-443nm 또는 이에 상응하는 범위의 하이브리드 검출기를 사용하여 영역을 시각화할 수 있습니다.</li>
	<li>절제 후에는 절제 전에 사용한 것과 동일한 설정으로 동일한 z-stack을 다시 이미징하여 절제를 구조적으로 확인합니다. 절제 부위에는 더 이상 형광 세포가 포함되어 있지 않습니다.</li>
</ol>5. 면역 세포 모집을 모니터링하기 위한 유충 회수 및 이미징
<ol><li>면역 세포 모집의 이미징을 지연시켜 수행해야 하는 경우 이미징 및 마취에서 유충을 회수합니다. 겸자나 해개 바늘을 사용하여 LMA에서 유충을 조심스럽게 제거합니다.<ol><li>먼저 유충을 덮고 있는 아가로스 층을 제거합니다. 둘째, 유충과 직접 접촉하는 아가로스를 제거합니다. 면역 세포 모집의 즉각적인 이미징이 이루어지는 경우 이 단계를 생략하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>유충을 순수한 E3 배지가 있는 접시에 다시 넣고 회복을 확인합니다. 회복은 유충의 수영에 의해 분명합니다.</li>
	<li>4 또는 6 hpl(병변 후 몇 시간)에서 동일한 현미경에서 동일한 설정을 사용하여 수술 부위를 다시 이미징하여 절제가 대식세포 모집에 미치는 영향을 확인합니다. 이렇게 하려면 이전에 수행한 대로 임베딩(3단계)과 이미징(4단계)을 반복합니다.</li>
	<li>이미징 후 LMA에서 유충을 제거합니다. 유충의 희생은 법적 요구 사항에 따라 얼음물에서 배양하거나 E3에서 MS-222를 과다 투여하여 수행할 수 있습니다. 그런 다음 표본을 후속 연구에 사용하거나 폐기할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 이미지 분석 및 통계 분석
<ol><li>Fiji32와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 획득한 데이터의 z 해상도에 따라 2D 또는 3D로 분석을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>주요 세포체를 식별하는 것과 같이 명확하게 분리된 세포를 포함하거나, 핵 라벨로 세포를 정량화하거나, 세포가 겹치는 경우 면적을 측정하여 대식세포를 수동으로 정량화합니다(다음 단계).</li>
	<li>면적을 정량화하려면 대식세포를 둘러싸는 마스크를 만듭니다. 이렇게 하려면 이미지 &gt; 임계값 조정 도구를 &gt; 피지에서 ROI(분석 &gt; 도구 &gt; ROI 관리자 &gt; 추가)를 만듭니다. 정량화를 위해 배경의 작은 입자를 제외합니다.<ol><li>그런 다음 면적을 측정합니다(분석 &gt; 측정). 겹치는 세포 형광 영역을 측정에 포함해야 하는지 여부를 고려하십시오. 참고: 여기에서, 모집된 대식세포는 이 영역에서 구별될 수 없기 때문에 원형 절제 영역은 면적 측정에서 생략되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 측정 결과를 플로팅하는 그래프를 생성합니다. 절제 전과 후의 데이터를 비교하려면 적절한 통계적 검정을 수행하십시오(여기서는 쌍을 이루는 단측 t-검정 이 수행됨). 참고: 그림은 사진 편집 및 그래픽 디자인 소프트웨어를 사용하여 준비할 수 있습니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 유충의 뼈 재생을 연구하기 위한 레이저 절제 방법

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<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>염화칼슘 이수화물, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>팁 모양 직선, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm</td></tr><tr><td>Falcon 6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 마이크로웰 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 14mm 유리 직경, 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>Insight X3 다광자 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 응용 제품군</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym 플라크 아가로스</td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>메이팅 케이지</td><td></td><td></td><td>다양한 종류(예: Tecniplast</td></tr>, <tr><td>Methyleneblue</td>, <td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr>, <tr><td>MS-222</td>, <td>SIGMA, Aldrich</td>, <td>A5040</td><td></td></tr>, <tr><td>염화칼륨, KCl,</td><td>PanReac AppliChem</td>, <td>131494</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, NaCl</td>, <td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 팔콘&nbsp;</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td></td>즈 <td>Insight X3 다광자 레이저 및 라이카 애플리케이션 제품군 소프트웨어</td></tr><tr><td>장착 스테인리스 스틸 해부 바늘</td><td>Bochem</td><td>12010</td><td>140mm</td></tr><tr><td>실체 현미경 시스템 SZX16</td><td>올림푸스</td><td></td><td>LED 조명 베이스 장착 SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>온도 조절 캐비닛 TS - WTW</td><td>물관부</td><td>TS 608/2-i</td><td>배양(배아)</td></tr><tr><td>이식용 피펫, 3.5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, 투명</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 버전 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td>, <td>Axiocam MRm 카메라 및 AxioVision 소프트웨어 탑재</td></tr></tbody></table>

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 two-photon 레이저 매개 절제

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

레이저 절제술은 위의 프로토콜에 표시된 대로 수행되었습니다. 절제 부위의 조골세포의 GFP 신호는 절제 후 즉시 사라졌습니다. 면역 반응 측면에서 조골세포 절제의 반응을 연구하기 위해 6 dpf 유충에서 6 hpl 전과 6hpl에서 대식세포의 존재를 이미지화했습니다. 절제 전에는 수술 영역(opercle area) 10 에서 대식세포가 거의 관찰되지 않았습니다(그림 2). 6 hp에서, 절제된 opercle 영역에 대식세포가 강하게 축적되고 opercle 및 opercle 주변 영역을 포함하여 시야에서 대식세포의 수가 증가하는 것이 감지되었습니다10 (그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> 그림 2: 6 dpf 제브라피시 유충에서 6 hpl의 대식세포 모집. 절제가 없는 수술 부위 및 6 hpl. 수술 조골세포는 녹색으로, 대식세포는 자홍색으로 표시되며, 점선 원은 레이저 절제 부위를 나타냅니다. 척도 막대: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
대식세포 모집은 또한 4 hpl에서 훨씬 더 작은 opercles를 가진 4 dpf 유충에서 유사한 결과를 관찰하여 분석되었습니다 (그림 3). 대식세포 수(즉각적인 레이저 절제 부위 외부)의 정량화는 조사된 시간 프레임 내에서 증가를 보여주었습니다(절제 전 대식세포 4.00 ± 2.37 대식세포 대 4hp에서 7.00 ± 2.76 대식세포)( 그림 3B). 마찬가지로, 대식 세포 면적 (절제 전에 μm2, 785.8 μm2 ± 723.1 μm2 로 측정 된 것과 4 hpl에서 1553 μm2 ± 869.9 μm2 로 측정 됨)이 증가했습니다 (그림 3C). 대식세포는 때때로 구별하기 어렵기 때문에 여기에서와 같이 대식세포 수 대신 대식세포 면적을 측정하는 것이 권장됩니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> 그림 3: 4 dpf 제브라피시 유충에서 4 hpl의 대식세포 모집. (A) 절제가 없는 수술 부위 및 4 hpl. 수술 조골세포는 녹색으로, 대식세포는 자홍색으로 표시되며, 점선 원은 레이저 절제 부위를 나타냅니다. 스케일 바: 50 μm. (B) 절제 직전(0 hpl) 및 절제 후(4 hpl)의 수술 부위에 있는 대식세포 수의 정량화. (C) 대식세포 영역의 정량화(레이저 절제 부위 제외). 쌍체 단측 t-검정. 각 점은 한 유충의 데이터를 나타내며 SD± 평균이 표시됩니다(n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

이 비디오는 두 개의 광자 레이저 축삭 절개술을 사용하여 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 손상으로부터 축삭 회복을 관찰하는 방법을 설명합니다.

이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법

출처: Morsch, M.,   et. al., Triggering cell stress and death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오에서는 형질전환 제브라피시의 개별 뉴런을 정확하게 표적화하고 연구하기 위한 고강도 UV 레이저 절제 기술을 살펴봅니다. 우리는 신경 반응을 준비하고, 고정하고, 시각화하는 방법을 보여주며, 부상과 회복의 세포 역학을 강조합니다.

컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오에서,  이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

여기, 우리는 프로토콜 Zebrafish 애벌레에서 2 광자 레이저로 뉴런의 유전자 표시 부분 모집단을 ablate을 제시.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

배아 발달은 세포 운동의 대규모 조정을 요구합니다. 2광자 포동 중재 레이저 절제는 심층 세포의 큰 그룹의 공간 적으로 제어 된 3 차원 절제를 허용한다. 또한, 이 기술은 생체 내에서 집단적으로 이동하는 세포의 반응을 기계적 환경에서 의 동요로 조사할 수 있다.

얼룩말 피시 가스트룰라의 2광자 현미경을 사용하여 깊고 공간적으로 제어된 볼륨 절제

명시야 기반 입체 현미경을 사용하여 전체 조직 규모에서 제브라피시 유충 꼬리 지느러미 재생의 역학을 캡처하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 해상도로 재생 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 방법론은 CCD 카메라와 타임랩스 소프트웨어가 장착된 모든 실체현미경에 적용할 수 있습니다.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

학습하세요 제브라피시 유충에서 two-photon 레이저 매개 절제를 이용한 골재생 및 면역 반응 연구 방법을. 이 기술은 조골세포 재생 메커니즘 규명에 활용됩니다.

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

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