Name: 반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용하여 4가지 자궁 NK 세포 아형을 측정하는 방법을. 반복적인 착상 실패가 있는 여성의 자궁 수용성을 평가하는 데 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Exploring Uterine NK Cell Heterogeneity in the Endometrium with Multiplex IHC

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</ol>

<table><tbody><tr><td>CD49a</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-76478</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Leica</td><td>NCL-L-CD56-504</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CD16</td><td>abcam</td><td>ab183354</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>R& D</td><td>MAB172</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>증폭 희석제</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1498 시리즈</td><td>형광단 희석 완충액</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1001EA</td><td>항체</td></tr><tr><td>구연산염 완충 용액 희석, pH 6.0 /9.0(10x)</td><td>Akoya Biosciences</td><td>A6001/A9001</td><td>항원 회수 솔루션</td></tr><tr><td>inForm 고급 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Akoya Biosciences</td><td>inForm 조직 찾기 소프트웨어 2.2.6</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Mantra 워크스테이션</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS140089</td><td>분광 이미징</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>Akoya Biosciences</td><td>인버터</td><td>마이크로파 스트리핑</td></tr><tr><td>TSA 520</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1487001K</td><td>적합한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>TSA 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001K</td><td>적합한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>TSA 650</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001K</td><td>적합한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>TSA 570</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001K</td><td>적합한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 코팅 슬라이드</td><td>Fisher Technologies</td><td>120-550-15</td><td>일상적인 조직학적 사용을 위한 슬라이드</td></tr><tr><td>PolyHRP Broad Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Invitrogen&trade; &nbsp; 플루오로마운트-G&트레이드; 마운팅 매체</td><td>ThemoFisher 과학</td><td>495802</td><td>설치</td></tr><tr><td>스펙트럼 DAPI</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1490A</td><td>핵산 염색</td></tr></tbody></table>

반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 nk 세포 아형 측정

Measurement of Four Uterine NK Cell Subtypes Using Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining in Women with Repeated Implantation Failure

자연 주기를 겪는 여성의 자궁내막 검체 채취 시기의 일관성을 유지하기 위해 황체 형성 호르몬(LH) 급증을 정확하게 감지하기 위해 소변 검사를 수행했으며, LH 급증 후 7일 후에 자궁내막 생검을 실시했습니다. HRT 주기를 겪는 여성의 경우, 프로게스테론 보충이 시작된 후 정확히 5일 후에 샘플을 예약했습니다. 자궁내막에 있는 NK 세포의 다양한 아형을 정량화하기 위해 m-IHC 염색이 사용되었습니다. 실험 절차의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
실험 절차의 최적화는 실험 결과의 정확성과 일관성을 보장하기 위해 고품질 m-IHC 염색 결과를 달성하는 데 매우 중요합니다. 처음에는 항원 회수 용액 AR6 또는 AR9를 선택하여 적절한 항체 농도를 결정하기 위해 IHC를 사용했습니다. CD56, CD16 및 CD49와 같은 항체의 경우 pH 6의 항원 회수 용액을 권장하는 반면, CXCR4 항체의 경우 pH 6 완충액에 비해 pH 9의 항원 복구 용액을 사용하여 우수한 염색 결과를 얻을 수 있었습니다. 항체 희석 비율, 배양 시간 및 항원 회수 조건을 포함한 매개변수가 결정되면 항체의 친화도에 따라 가장 적합한 TSA 염료를 선택할 수 있습니다. 항체의 높은 친화력을 보완하기 위해 형광 밝기가 약한 염료를 선택해야 합니다. TSA 염료의 신호 강도에 대한 참조 데이터는 표 2에서 찾을 수 있습니다. TSA 모노플렉스 분석이 완료된 후 TSA 멀티플렉스의 순서를 결정할 수 있습니다. 4개의 항체가 uNK 세포의 서로 다른 아형을 식별하도록 설계되었다는 점을 감안할 때, 항체 간의 공동 국소화는 불가피합니다. 스펙트럼 중복을 최소화하고 형광 부분 간의 간섭을 방지하기 위해 파장이 가능한 한 멀리 떨어진 형광 부분을 선택하고, TSA 멀티플렉스의 포지티브 신호의 위치 및 수를 TSA 모노플렉스의 신호와 비교하여 식별을 확인하고(그림 2), 명확한 배경을 보장(그림 3)16 전략을 사용했습니다.
m-IHC 염색 절차의 최적화 및 완료 후 이미징 워크스테이션을 이미지 획득에 사용하고 이미지 분석 소프트웨어를 적용하여 이미지의 심층 분석을 수행했습니다(그림 4). uNK 세포의 분류를 위해 전통적인 방법과 혁신적인 방법이 모두 사용되었습니다. 전통적인 분류는 NK 세포를 CD16의 발현 수준에 따라 CD56+CD16- 및 CD56+CD16+17의 두 가지 범주로 나눕니다. 이러한 토대 위에서 우리는 새로운 분류 전략을 사용하여 NK 세포 이질성을 더욱 명확하게 설명하고자 했습니다. 이전 연구의 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq)을 사용하여 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)로 개별 NK 세포를 분리하고 RNA 염기서열분석을 수행하여 각 세포의 전사체 프로필을 캡처했습니다. 분석 결과, NK1(CD56+CD49a+CXCR4-), NK2(CD56+CD49a+CXCR4+), NK3(CD56+CD49a-CXCR4-), NK4(CD56+CD49a-CXCR4+)의 4가지 뚜렷한 NK 세포 아형이 발견되었다. 이러한 아형은 CD49a와 CXCR4의 차등 발현을 특징으로 하며, CD56은 모든 NK 세포에 대한 보편적인 마커 역할을 합니다. CD49a는 NK1 및 NK2 아형에서 특이적으로 검출된 반면, CXCR4는 NK2 및 NK4 아형에서 검출되었습니다. 이 분류를 검증하기 위해 유세포 분석을 수행하여 서브타이핑 방법의 정확성을 확인했습니다(그림 5)9. 각 uNK cell subtype의 비율은 총 기질 세포 수에 대한 백분율로 표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67284/67284fig01v2.jpg"> 그림 1: 자궁내막 NK 세포 분석의 워크플로우 다이어그램. 주요 단계에는 자궁내막의 획득 및 수집, m-IHC 패널의 최적화, 자궁내막의 m-IHC 염색, 이미지 획득 및 분석이 포함됩니다. Created with BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67284/67284fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67284/67284fig02v3.jpg"> 그림 2: DAB, TSA monoplex 및 TSA multiplex staining을 통한 바이오마커의 정량화를 위한 대표 이미지. DAB(왼쪽 패널), TSA monoplex IHC(중간 패널) 및 TSA multiplex IHC(오른쪽 패널)로 염색된 각 항체의 대표 이미지는 m-IHC의 발달을 통해 최소한의 편차를 보여주었습니다. 아래의 TSA 시뮬레이션 IHC 이미지는 해당 명시야 이미지를 매우 모방합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67284/67284fig02largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67284/67284fig03.jpg"> 그림 3: 자궁내막의 m-IHC 염색 후 실험 결과. (A) 이미저를 사용하여 200x 배율로 혼합되지 않은 이미지를 획득했습니다. (B) 이 혼합되지 않은 이미지의 추가 확대. (C-F) 이미징 소프트웨어를 사용하여 혼합을 해제한 후 TSA 염료 570(CD16), TSA 염료 650(CD56), TSA 염료 620(CXCR4) 및 TSA 염료 520(CD49a) 채널에서 이미지를 관찰했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67284/67284fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67284/67284fig04.jpg"> 그림 4: m-IHC 염색 이미지 분석. 이미지는 이미징 소프트웨어의 (A) 조직 분할, (B) 세포 분할 및 (C) 세포 표현형 기능을 사용하여 분석되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67284/67284fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67284/67284fig05v3.jpg"> 그림 5: 자궁내막 NK 세포의 아형 분석. (A) 기존의 자궁내막 NK세포는 CD16 발현에 기초하여 CD56+CD16-NK세포와 CD56+CD16+NK세포로 분류할 수 있다. (B) 혁신적인 아형 분석법은 자궁내막 NK 세포를 NK1(CD56+CD49a+CXCR4-), NK2(CD56+CD49a+CXCR4+), NK3(CD56+CD49a-CXCR4-), NK4(CD56+CD49a-CXCR4+)의 4가지 범주로 분류했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67284/67284fig05largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>염색 주기</td>
			<td>마커</td>
			<td>클론</td>
			<td>회사</td>
			<td>제품</td>
			<td>항체 희석</td>
			<td>AR 버퍼</td>
			<td>형광단</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>CD49a (CD49a)</td>
			<td>씨엘7207</td>
			<td>노부스 바이오로직스</td>
			<td>NBP2-76478</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>AR6</td>
			<td>TSA 520</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>CD56 (CD56)</td>
			<td>CD564 시리즈</td>
			<td>라이카</td>
			<td>NCL-L-CD56-504</td>
			<td>1:100</td>
			<td>AR6</td>
			<td>TSA 650</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>CD16 (CD16)</td>
			<td>SP175 시리즈</td>
			<td>앱캠</td>
			<td>ab183354</td>
			<td>1:100</td>
			<td>AR6</td>
			<td>TSA 570</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>CXCR4 (영문)</td>
			<td>44716</td>
			<td>연구개발(R&amp;D)</td>
			<td>MAB172</td>
			<td>1:100</td>
			<td>AR9</td>
			<td>TSA 620</td>
		</tr></tbody></table>표 1: m-IHC에 사용된 항체 및 TSA 염료의 농도 목록.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>형광단</td>
			<td>진언</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 520</td>
			<td>높다</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 540</td>
			<td>보통</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 570</td>
			<td>보통</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 620</td>
			<td>보통</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 650</td>
			<td>높다</td>
		</tr><tr><td>TSA 염료 690</td>
			<td>낮다</td>
		</tr></tbody></table>표 2: TSA 염료 및 해당 형광 강도.

반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정

Immunohistochemistry (IHC) plays a crucial role in biological research and clinical diagnosis, serving as the most commonly used method for identifying ...

measurement-four-uterine-nk-cell-subtypes-using-multiplexed

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

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신경 근육 질환의 마우스 모델에서 호흡 근육 활동 및 환기의 반복 측정

이식된 삼투펌프를 통한 이소프로테레놀의 만성 투여는 마우스의 고급 심부전을 모방하기 위해 널리 사용되어 왔다. 여기서, 우리는 성공적인 모델 생성을 위한 심초음파 평가뿐만 아니라 3주 동안 의 지속적인 이소프로테레놀 투여를 위한 수술용 미니 펌프 이식에 대한 상세한 방법을 설명합니다.

마우스에서 심부전을 유도하는 이소프로테레놀 미니 펌프 의 이식

이 프로토콜은 심부전 환자에서 운동 과민증에서 대뇌 혈역학 반응의 참여를 확인하기 위해 기존의 심폐 운동 테스트에 근적외선 분광법을 통합했습니다.

심부전 환자에서 심폐 운동 테스트에서 뇌 조직 포화 모니터링의 통합

이 문서의 목적은 실험실 마우스의 정교한 삽관 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 비침습적이며, 따라서 호흡기 기능의 연속 모니터링 및 / 또는 폐로의 치료 의 주입을 필요로하는 연구에 이상적입니다.

마우스에서 반복된 Orotracheal 삽관

이 프로토콜은 흡수 가능한 봉합사를 사용하여 일시적인 심근 비대증을 얻는 향상된 방법을 제시하며 압력 과부하를 제거 한 후 좌심실 비대 감소를 시뮬레이션합니다. 심근 대위 축 대 사전 조절에 대 한 연구에 대 한 가치가 있을 수 있습니다.

과도 심근 비대증을 얻기 위해 흡수 가능한 봉합사와 횡단 대동맥 수축 을 작동

학습하세요 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용하여 4가지 자궁 NK 세포 아형을 측정하는 방법을. 반복적인 착상 실패가 있는 여성의 자궁 수용성을 평가하는 데 활용할 수 있습니다.

반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정

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