Name: 홍합(Mytilus galloprovincialis) 혈구 운동성을 기반으로 한 독성 및 생태 독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 Mytilus galloprovincialis 혈구 운동성을 활용한 독성 및 생태 독성 평가 방법입니다. 시차 현미경과 세포 추적 소프트웨어를 사용하여 오염 물질의 영향을 민감하게 측정하고 환경 모니터링 및 생태학적 위험 평가에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
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<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
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<li>Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+vibrios+in+marine+bivalves%3A+The+role+of+interactions+with+hemolymph+components%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components.</a> Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).</li>
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<li>Furukawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte+migration+and+expression+of+four+Sox+genes+during+wound+healing+in+Pacific+abalone%2C+Haliotis+discus+hannai%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai.</a> Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m 필터 (직경 25mm)</td> <td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>labware</td></tr><tr><td>2.5 ml 피하 주사기 needdle 22G</td><td>광선</td><td>2522CM32</td><td>labware</td></tr><tr><td>96-well flat-bottom 폴리스티렌 TC 처리 microplate</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>labware</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td>화학</td></tr><tr><td>화학요법 및 마이그레이션 도구 소프트웨어&nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>장비: 세포 이미징 멀티모드 리더</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)&nbsp;</td><td>머크 (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 튜브 원뿔형 바닥</td><td>코닝</td><td>352196</td><td>실험실 용품</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td>화학</td></tr><tr><td>혈구계 빠른 읽기 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>실험기구</td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td>화학</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td>화학</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk&nbsp;</td><td>104936</td><td>화학</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>머크 (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>세포 배양 배지용 필수 아미노산</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>M2670</td><td>화학</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merk(시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>M7506</td><td>화학</td></tr><tr><td>현미경 Nikon Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td>장비: 세포 이미징&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>화학</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (시그마 - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>화학</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>화학</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (시그마 - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td>화학</td></tr><tr><td>중성 레드</td><td>머크 (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>바이탈 셀 염료</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>머크 (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>세포 배양용 항생제</td></tr><tr><td>SrCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>255521</td><td>케미컬</td></tr><tr><td>트리판 블루&nbsp;</td><td>머크 (시그마 - 알드리치)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>세포 염료</td></tr></tbody></table>

홍합(mytilus galloprovincialis) 혈구 운동성을 기반으로 한 독성 및 생태 독성 분석

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

이 연구는 Mytilus galloprovincialis hemocytes의 운동성을 활용하여 오염 물질의 독성 및 생태 독성을 빠르고 민감하게 평가하기 위한 새로운 체외 방법을 소개합니다. 그림 1A-C는 우물 바닥에 30분 부착 후 혈구의 대표적인 타임 랩스 이미징을 보여줍니다. 그림의 세포는 운동성 평가 직전에 중성 적색으로 염색되었습니다. 세포 이동은 다중 모드 리더와 함께 20배 배율로 10분 동안 1분에 한 개의 이미지 속도로 광학 현미경을 사용하여 모니터링되었습니다. 그림 1A-C는 동일한 관심 영역(ROI)에서 캡처된 11개 프레임 중 3개를 0분, 5분, 10분에 표시합니다. 세 그림 모두에서 동일한 셀에 번호가 매겨져 움직임을 강조하고 숫자 지정은 그림 전체에서 일관되게 유지되어 궤적을 명확하게 보여줍니다.
세포는 층상 족부 활동과 빠른 형태 변화를 기반으로 한 단세포 움직임을 보여줍니다. 세포는 추적 중 시각화를 개선하기 위해 필수 염료인 Neutral red로 라벨링되었습니다. 중성 빨간색은 양친매성이며 약한 양이온성 염료로 세포막을 쉽게 투과할 수 있습니다. 일단 세포 내부로 들어가면 염료는 양성화로 인해 리소좀에 갇히게 됩니다. 홍합 혈구, 특히 과립구는 잘 발달된 리소좀 시스템을 보여줍니다. 따라서 Neutral Red 염색으로 잘 시각화되며, 세포질에는 여러 개의 적색 표지 리소좀이 풍부하고 핵(염료에 의해 표시되지 않음)은 반투명 구멍으로 나타납니다.
프로토콜의 적용을 통해 Udayan et al.23에 따르면 두 가지 주요 혈구 형태형을 관찰할 수 있습니다: (1) 양극성 콩 모양과 때로는 아메바 윤곽을 가진 세포와 더 작은 둥근 별 모양의 세포(세포 n = 3 및 10)를 퍼뜨립니다. 두 세포 유형 모두에서 움직임은 가성족파(pseudopodia)와 필로포디아(filopodia)의 지속적인 확장 및 수축과 함께 지속적인 형태 변화를 특징으로 했습니다.
프로토콜 애플리케이션을 사용하면 그림 2에 보고된 바와 같이 궤적 플롯을 구성하고 평균 속도 및 직접성과 같은 주요 속도 측정 매개변수를 계산하여 혈구 운동성을 성공적으로 평가할 수 있습니다. 이들은 각각 퍼진 세포의 경우 6.46 ± 0.2 μm/min 및 0.56 ± 0.02 (평균 ± SEM)에 해당하며, 웰 바닥에 30분 부착한 후 기초 생리학적 조건에서 각각 5.18 ± 0.34 μm/min 및 0.37 ± 0.03에 해당했습니다. 따라서 이 프로토콜은 속도 측정 매개변수를 기반으로 다양한 혈구 집단을 분류할 수 있습니다.
프로토콜의 적용을 통해 약물 또는 오염 물질에 노출된 후 혈구 운동성의 속도 측정 매개변수의 변화를 감지할 수 있습니다. 도 3A-D는 전 세계 강에서 농도가 가장 높고 검출 빈도가 가장 높은 환경(PiE) 중 하나인 파라세타몰(paracetamol)에 홍합 혈구를 시험관 내에서 노출시킨 대표적인 결과를 보여줍니다31.
Udayan et al.23에 따르면, 대조 세포에서 두 세포 형태형에서 시간에 따른 속도의 현저한 증가가 관찰되었으며, 이는 24시간 배양 중 혈구의 활성화를 시사하며, 이는 아마도 배양 환경에서 철수 및 도금에 의해 실험적으로 유도된 염증 반응을 연상시키는 것으로 보입니다. 세포가 약물에 노출되었을 때, 혈구의 운동성 활성화는 24시간 후에 퍼진 세포(그림 3A)에서는 현저히 감소했지만 작은 원형 세포(그림 3C)에서는 감소하지 않았으며, 이는 더 낮은 평균 기저 속도(시간 0에서 평가된 바와 같음)를 특징으로 합니다. 또한, 이 프로토콜은 약물 노출 후 세포 궤적 변화를 감지할 수 있게 했으며, 이는 24시간 후 스몰 셀의 직접성이 크게 증가하고 확산 세포에서 1시간 노출 후 직접성이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 3C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
그림 1: 우물 바닥에 부착한 지 30분 후 중성 붉게 염색된 적혈구의 대표적인 타임 랩스 이미징. 세포는 운동성 평가 직전에 활성 염료인 Neutral Red로 염색되었습니다. 세포 움직임은 광학 현미경을 사용하여 20배 배율로 10분 동안 1분마다 하나의 이미지 비율로 모니터링되었습니다. 간결성을 위해 패널 A, B 및 C 는 동일한 관심 영역(ROI)에서 캡처된 11개 프레임 중 3개를 0분, 5분 및 10분에 표시합니다. 세 그림 모두에서 동일한 셀에 번호가 매겨져 움직임을 보여 주며 화살표는 시간 간격을 나타냅니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
그림 2: M. galloprovincialis hemocytes 의 대표적인 궤적 플롯. 표시된 궤적은 하나의 우물에서 나옵니다. 25개 셀의 궤적이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
그림 3: 파라세타몰 노출(24시간)이 확산 세포(A,B)와 작은 둥근 별 모양 세포(C,D)의 속도 및 직접성에 미치는 영향. 데이터는 SEM± 평균으로 표현됩니다. 데이터의 통계적 유의성은 일원 ANOVA와 Tukey의 사후 검정으로 평가되었습니다. *p &lt; 0.05 대 컨트롤 (p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

홍합(Mytilus galloprovincialis) 혈구 운동성을 기반으로 한 독성 및 생태 독성 분석

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

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배우세요 Mytilus galloprovincialis 혈구 운동성을 활용한 독성 및 생태 독성 평가 방법입니다. 시차 현미경과 세포 추적 소프트웨어를 사용하여 오염 물질의 영향을 민감하게 측정하고 환경 모니터링 및 생태학적 위험 평가에 활용할 수 있습니다.

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